TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Francis Crick in his office. Behind him is a m...
Francis Crick. Fuente: wikipedia

Francis Crick in his office. Behind him is a model of the human brain that he inherited from Jacob Bronowski. (Photo credit: Wikipedia)

¿A qué se denominan técnicas de biología molecular?

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment length polymorphism), que significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Aqui les dejo para que vean como se hace una extracción de ADN en forma casera. Hagan click aquí

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.

La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

Primeras etapas de la extracción de ADN, en este caso precipitado de células a partir de las cuales se obtendrá el ADN. Fuente: Science Photo library
Primeras etapas de la extracción de ADN, en este caso precipitado de células a partir de las cuales se obtendrá el ADN. Fuente: Science Photo library
ADN precipitado en alcohol Fuente: Science photo library.  La figura muestra el pellet o precipitado de células a partir del cual se obtendrá el ADN
ADN precipitado en alcohol Fuente: Science photo library. La figura muestra el pellet o precipitado de células a partir del cual se obtendrá el ADN

¿Como visualizamos el ADN?

Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.

Para eso debemos preparar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras para que queden sumergidas en el gel y este en un buffer o solución tampón conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica. De esta forma el ADN migra al polo positivo (ya que tiene carga negativa). Los fragmentos muy pequeños migran muy rápido en cambio los más grandes migran más lentamente, permaneciendo cerca del pocillo donde se depositaron. El ADN previamente o el gel deben ser teñidos con bromuro de etidio, que es un colorante naranja que emite ese color solo bajo luz UV. Como se intercala entre los nucléotidos del ADN, el fragmento de ADN se verá naranja.

Gel de control de amplificación por PCR teñido con bromuro de etidio
Gel de control de amplificación por PCR teñido con bromuro de etidio y visto en un transiluminador de luz ultravioleta (UV de 302nm). La PCR se realizó de un segmento de un gen (exón) en tres individuos. 1er, 3ro y 4to pocillo contienen ADN de distintos animales que se amplificó. En el 2do pocillo (de izq. a derecha, no hubo amplificación), o sea falla de la técnica. En el último pocillo (derecha) se ve un marcador de peso molecular, para indicar el tamaño de la banda de ADN (en este caso 130 pares de bases)
Fuente: Science photo Library. Estos son los pocillos donde se siembra el ADN (con una micropipeta), se ven azules por otro colorante que se usa para ver por donde esta migrando el ADN
Fuente: Science photo Library. Estos son los pocillos donde se siembra el ADN (con una micropipeta), se ven azules por otro colorante que se usa para ver por donde esta migrando el ADN sin necesidad de mirarlo bajo luz ultravioleta. Además el colorante azul contiene glicerol que ayuda a que el ADN baje rápidamente al fondo del pocillo

En el siguiente video se muestra como se realiza un gel de agarosa

La genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.

Esquema o cuadro del significado de cada uno de los 64 posibles codones y los aminoácidos que codifican
Esquema del Código Genético

Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su practicidad y rapidez para amplificar una región de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis. Para saber si la PCR ha resultado, se colocan las muestras en pocillos de geles de agarosa, teñidos con bromuro de etidio (color naranja)

La técnica se describe en los videos que les dejo abajo

Para reírse un rato les dejo un video divertido llamado  “La canción de la PCR” de una empresa (BIORAD) que vende los termocicladores o Máquinas para automatizar la técnica para hacer PCR

La secuenciación o forma de determinar el orden de los nucléotidos en el ADN de cada cromosoma fue descubierta por Sanger

Gracias a este descubrimiento fueron posibles el uso de muchas técnicas para realizar tanto la secuenciación completa del genoma humano como el de muchos animales domésticos y ademas usar la secuenciaciónque hoy en día es automática y realizada por un secuenciador en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los secuenciadores es el fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la realización de test de paternidad como identificación de criminales. En las primeras épocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por Sir Alec Jeffries y se realizaba por Southernblot, técnica denominada así en honor a su descubridor llamado de apellido Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para la identificación de fragmentos de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al ADN de un gel de agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda marcada radioactivamente. Luego llegaron el northern (para detectar ARN) y el western para detectar fragmentos de ARN proteínas respectivamente.

La forma de llevar a cabo esta técnica se puede ver en el siguiente video

Método de Secuenciación descrito por Sanger y basado en el freno de la síntesis de ADN cuando se usan dideoxinucleótidos en vez de desoxiribonucleótidos. Parte de eso se explica en el video que les dejo abajo

Secuenciación de Sanger

Principios de fingerprint o identificación de huellas de ADN derivada de la primera técnica descrita por Sir Alec Jeffries.

Geles para evaluar uso de microsatélites o VNTRs (número variable de repeticiones en tandem) o fingerprints

Secuenciación basada en metodo de Sanger pero ahora realizada por un secuenciador automático.

Secuenciación de ADN automática (secuenciadores) basado en el uso de la técnica de Sanger usando fluorocromos

Aplicaciones de las técnicas

Son innumerables las aplicaciones de estas técnicas y las que más han sido usadas, son la PCR seguida de una restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de poliacrilamida que tiene más definición para la separación de fragmentos de pocas bases de diferencias. Eso sí en los últimos años y con la baja en los precios de la secuenciación y los microarrays, se usa más la PCR seguida de secuenciación directa. Cuando se usa PCR y enzimas de restricción, a esa combinación de técnicas se las denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud de los fragmentos de restricción en ingles).

Las enzimas de restricción o también denominadas “endonucleasas” cortan los enlaces fosfodiéster del ADN cuando reconocen determinada combinación de nucléotidos o bases del ADN, generalmente de 6 o 4 pares de bases de longitud, llamadas secuencias palindrómicas, es decir que se leen igual en un sentido en una cadena y en el sentido opuesto en la cadena complementaria. Se utilizan mucho para el diagnóstico de enfermedades hereditarias causadas por una mutación puntual o detección de variantes o alelos de un gen favorable para el mejoramiento genético animal o vegetal.

¿Por que detectan mutaciones estas enzimas ?  porque como reconocen una secuencia específica de 6 o 4 pares de bases, al aparecer una mutación se puede perder el que era un sitio de corte para una enzima o al revés se puede generar un sitio de corte en el ADN.

Diagnóstico a través de un gel de agarosa donde se ven los fragmentos (PCR/RFLP)
Fuente

Si podemos amplificar por PCR un segmento o porción de un gen, y luego le agregamos una enzima de restricción puede que se produzcan fragmentos, si en el ADN amplificado hay una o varias de esas combinaciones de 6 o 4 pares de bases. Quizás al comparar el gen normal con el mutado, se haya perdido o ganado un sitio de restricción para alguna de las miles de enzimas de restricción conocidas

Tipos de enzimasde restricción armendariz_ch13_fig-13-01
Ejemplos de dos tipos de enzimas de restricción.

Algunas de las miles de enzimas conocidas son:

Algunas de las enzimas de restricción de extremos romos y pegajosos
Fuente ALL Science

A modo de ejemplo y usando la imagen de arriba, si  por una mutación de la secuencia que reconoce BamHI, en vez de CCTAGG se cambia a CTTAGG, en ese segmento de ADN se pierde el sitio de corte de BamHI porque deja de reconocerlo y no corta. De modo que en un alelo normal, la enzima BamHI corta, por ejemplo generando dos fragmentos pero en el alelo mutado ya no corta, con lo que veríamos en un gel, solo un fragmento.  (puede verse graficado abajo)

Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.

Un esquema se muestra para ver en que se basa el diagnóstico

pcr-rflp alelos-normal-y-mutado
Esquema original de JPH Cor 2004, modificado por Gabriela Iglesias
Esquema de la técnica de PCR-RFLP
Esquema original de JPH Cor 2004, modificado por Gabriela Iglesias

En el caso de los test de paternidad, hoy en día se hacen por PCR seguida de un análisis de unos 9 a 13 VNTRs (numero variable de repeticiones en tandem del tipo de los minisatélites o secuencias de a 10 hasta 60 bases que se repiten) en una misma reacción seguida de la visualización en geles de poliacrilamida con la ayuda de un secuenciador automático. En este caso se amplifican sitios específicos del genoma, que poseen un numero variable de secuencias repetidas. actgactgacgt actgactgactg actgactgactg actgactgatga actgactgactg En este caso son 12 pb que se repiten 4 veces en uno de nuestros cromosomas (el materno o paterno) o sea que quizás yo (Gabriela) poseea 3 repeticiones en el materno y 10 en el paterno. Otra persona podría tener 5 y 15, otra 10 y 12 etc. Cuanto más variable es el numero de repeticiones, más precisa es la técnica. De este tipo de repeticiones se amplifican por PCR varias distintas (localizadas en distintas regiones del genoma) 9 a 13 en cada individuo y los fragmentos se ven luego en geles y se separan por tamaños. El esquema de abajo muestra un ejemplo con sólo 3 repeticiones en el Individuo A, B y C. El tamaño de la banda de lo amplificado varía según el No de repeticiones que cada persona tenga. Otros tipos son los STRs (short tandem repeats o repeticiones cortas en tandem de 2 a 6 pb de longitud que se repiten) Por ejemplo GCGA.GCGA.GCGA etc

Esquema de VNTRs o microsatélites y su interpretación
Imagen original de la Universidad de Arizona, traducida por Gabriela Iglesias
Interpretación en geles de los VNTRs
Ejemplo de 3 VNTRs en 3 diferentes individuos. Por ejemplo, se representan en distintos colores 3 pares de cromosomas homólogos y 3 VNTRs o repeticiones en tres cromosomas distintos. El No 1 en un cromosoma (azul ) con dos variantes en cada homólogo, por ejemplo en el materno 24 pares de bases (por ejemplo sea 6 repeticiones de 4 nucleótidos) y en el cromosoma paterno del Individuo A: unas 3 repeticiones de 4 bases: 12 nucleótidos en total. Eso da como resultado en un gel: dos bandas una de unas 24 pares de bases y una de 12 pares de bases. En la misma reacción de PCR se amplifican los tres minisatélites. Por ende cada individuo muestra un patrón de bandas, producto de la cantidad de bases de cada repetición por el numero de bases que se repiten de cada VNTR amplificado . En este caso el individuo A tiene las bandas de 24 y 12 del VNTR 1, una de menos de 5 bases y una de 15 bases del cromosoma verde (VNTR 2) y una de 10 y otra de 30 del cromosoma rojo (VNTR 3). Este individuo A es heterocigota para los 3 VNTRs Imagen modificada por Gabriela Iglesias

Otro ejemplo se ve en la siguiente imágen

Esquema del uso de VNTRs  y sus usos
En este caso hay otro ejemplo de dos VNTRs A y B en dos individuos 1 y 2. Cada VNTR tiene dos variantes o alelos, el A por ejemplo, A5 y A2 en el Individuo 1 o el A3 y A4 en el Individuo 2. Imagen obtenida de DNA Profiling
Análisis de varios VNTRS al mismo tiempo Fuente: Sciencephotolibrary
Análisis de varios VNTRS al mismo tiempo Fuente: Sciencephotolibrary

Usos en la criminología o medicina forense en este caso con Southern blot y RFLP

 

Southern blot de uso forense Crédito de Pearson education
. Southern blot de uso forense Crédito de Pearson education
Test de ADN por southern blot de uso forense. Imagen de Lifecod Standford

Otros ejemplos de usos en test de paternidad se ven en la siguiente imagen.

Usos como en los test de paternidad de los STRs y VNTRs en test de paternidad de DNA profiling
Usos como en los test de paternidad de los STRs y VNTRs. Cada hijo debería mostrar que cada banda de un VNTR proviene o del padre o de la madre. Como se ve en la Hija No 1 (D1), o el el Hijo (S1), en cambio en el caso de la hija 2 (D2) parte de sus bandas las hereda de la madre pero no tiene las otras bandas provenientes del padre, al menos no todas. Probablemnete es hija de otro padre biológico. Finalmente el hijo S2 representado con bandas verdes, no comparte bandas ni del padre ni de la madre, por lo tanto podría ser un hijo no biológico. Imagen obtenida de DNA Profiling

Les dejo finalmente una clase en inglés sobre el tema pero pueden usar los títulos en español.

Ver presentaciones Power point en Pdf

Curso de Genética Molecular

213 comentarios sobre “TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

  1. Hola Dra. Gabriela
    Podrías darme ejemplos de el uso de técnicas bioquímicas y/o moleculares en CLINICAS VETERINARIAS. Tengo la información de técnicas como electroforesis, Elisa, fraccionamiento celular, citometria de flujo, cristalografia de rayos X etc
    pero no se especificamente cuando se utilizan en una clínica veterinaria.
    espero puedas ayudarme, Gracias!!

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    1. Hola Paula, si en el Blog mismo está lleno de artículos de usos de electroforesis y PCR en Medicina veterinaria. Hya varias monografías hechas por alumnos de detección de enfermedades hereditarias en animales. te dejo dos links aqui pero hay más, solo tenes que buscar en el blog. Una es esta y la otra es esta pagina
      Espero te sirvan
      saludos

      Le gusta a 1 persona

      1. HOLA DRA! QUISIERA SABER SI SE PUEDE MEDIR EL DAÑO DE LA OXIDACIÓN DE PROTEÍNAS O ADN OCASIONADO POR RADICALES MEDIANTE UNA SECUENCIACION POR MÉTODO SANGER……..?

        Me gusta

    1. Hola Luz, eso sería por muchas tecnologías posibles, pero para decirte o comentarte alguna podrías usar un virus al que se le remueven los genes patógenos, y se le introduce el gen en cuestión (esto depende del tamaño del gen, si es muy grande..no se puede). Luego una vez que el virus está armado, se lo podrias inyectar al deportista (esta es una de las posibles formas) pero en esta página no lo tengo descripto. Vas a poder encontrarlo usando plásmidos bacterianos tambien o cromosomas artificiales o inlcuso se ha probado inyectando ADN. La tecnica para introducir un gen en un plasmido bacteriano se llama transformación. Buscala en google hay mucho lugares que lo describen o buscá terapia génica. Aqui solo hay decriptas algunas técnicas generales que son necesarias para hacer luego estas cosas, por ejmplo para crtar ADN necesitas enzimas de restriccion. Siento no haber escrito sobre el tema en detalle. Saludos

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