TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Francis Crick in his office. Behind him is a model of the human brain that he inherited from Jacob Bronowski. (Photo credit: Wikipedia)

¿A qué se denominan técnicas de biología molecular?

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment length polymorphism), que significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Aqui les dejo para que vean como se hace una extracción de ADN en forma casera. Hagan click aquí

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.

La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

¿Como visualizamos el ADN?

Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.

Para eso debemos preparar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras para que queden sumergidas en el gel y este en un buffer o solución tampón conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica. De esta forma el ADN migra al polo positivo (ya que tiene carga negativa). Los fragmentos muy pequeños migran muy rápido en cambio los más grandes migran más lentamente, permaneciendo cerca del pocillo donde se depositaron. El ADN previamente o el gel deben ser teñidos con bromuro de etidio, que es un colorante naranja que emite ese color solo bajo luz UV. Como se intercala entre los nucléotidos del ADN, el fragmento de ADN se verá naranja.

En el siguiente video se muestra como se realiza un gel de agarosa

La genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.

Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su practicidad y rapidez para amplificar una región de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis. Para saber si la PCR ha resultado, se colocan las muestras en pocillos de geles de agarosa, teñidos con bromuro de etidio (color naranja)

La técnica se describe en los videos que les dejo abajo

Para reírse un rato les dejo un video divertido llamado  “La canción de la PCR” de una empresa (BIORAD) que vende los termocicladores o Máquinas para automatizar la técnica para hacer PCR

La secuenciación o forma de determinar el orden de los nucléotidos en el ADN de cada cromosoma fue descubierta por Sanger

Gracias a este descubrimiento fueron posibles el uso de muchas técnicas para realizar tanto la secuenciación completa del genoma humano como el de muchos animales domésticos y ademas usar la secuenciaciónque hoy en día es automática y realizada por un secuenciador en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los secuenciadores es el fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la realización de test de paternidad como identificación de criminales. En las primeras épocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por Sir Alec Jeffries y se realizaba por Southernblot, técnica denominada así en honor a su descubridor llamado de apellido Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para la identificación de fragmentos de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al ADN de un gel de agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda marcada radioactivamente. Luego llegaron el northern (para detectar ARN) y el western para detectar fragmentos de ARN proteínas respectivamente.

La forma de llevar a cabo esta técnica se puede ver en el siguiente video

Método de Secuenciación descrito por Sanger y basado en el freno de la síntesis de ADN cuando se usan dideoxinucleótidos en vez de desoxiribonucleótidos. Parte de eso se explica en el video que les dejo abajo

Principios de fingerprint o identificación de huellas de ADN derivada de la primera técnica descrita por Sir Alec Jeffries.

Secuenciación basada en metodo de Sanger pero ahora realizada por un secuenciador automático.

Aplicaciones de las técnicas

Son innumerables las aplicaciones de estas técnicas y las que más han sido usadas, son la PCR seguida de una restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de poliacrilamida que tiene más definición para la separación de fragmentos de pocas bases de diferencias. Eso sí en los últimos años y con la baja en los precios de la secuenciación y los microarrays, se usa más la PCR seguida de secuenciación directa. Cuando se usa PCR y enzimas de restricción, a esa combinación de técnicas se las denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud de los fragmentos de restricción en ingles).

Las enzimas de restricción o también denominadas “endonucleasas” cortan los enlaces fosfodiéster del ADN cuando reconocen determinada combinación de nucléotidos o bases del ADN, generalmente de 6 o 4 pares de bases de longitud, llamadas secuencias palindrómicas, es decir que se leen igual en un sentido en una cadena y en el sentido opuesto en la cadena complementaria. Se utilizan mucho para el diagnóstico de enfermedades hereditarias causadas por una mutación puntual o detección de variantes o alelos de un gen favorable para el mejoramiento genético animal o vegetal.

¿Por que detectan mutaciones estas enzimas ?  porque como reconocen una secuencia específica de 6 o 4 pares de bases, al aparecer una mutación se puede perder el que era un sitio de corte para una enzima o al revés se puede generar un sitio de corte en el ADN.

Si podemos amplificar por PCR un segmento o porción de un gen, y luego le agregamos una enzima de restricción puede que se produzcan fragmentos, si en el ADN amplificado hay una o varias de esas combinaciones de 6 o 4 pares de bases. Quizás al comparar el gen normal con el mutado, se haya perdido o ganado un sitio de restricción para alguna de las miles de enzimas de restricción conocidas

Algunas de las miles de enzimas conocidas son:

A modo de ejemplo y usando la imagen de arriba, si  por una mutación de la secuencia que reconoce BamHI, en vez de CCTAGG se cambia a CTTAGG, en ese segmento de ADN se pierde el sitio de corte de BamHI porque deja de reconocerlo y no corta. De modo que en un alelo normal, la enzima BamHI corta, por ejemplo generando dos fragmentos pero en el alelo mutado ya no corta, con lo que veríamos en un gel, solo un fragmento.  (puede verse graficado abajo)

Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.

Un esquema se muestra para ver en que se basa el diagnóstico

En el caso de los test de paternidad, hoy en día se hacen por PCR seguida de un análisis de unos 9 a 13 VNTRs (numero variable de repeticiones en tandem del tipo de los minisatélites o secuencias de a 10 hasta 60 bases que se repiten) en una misma reacción seguida de la visualización en geles de poliacrilamida con la ayuda de un secuenciador automático. En este caso se amplifican sitios específicos del genoma, que poseen un numero variable de secuencias repetidas. actgactgacgt actgactgactg actgactgactg actgactgatga actgactgactg En este caso son 12 pb que se repiten 4 veces en uno de nuestros cromosomas (el materno o paterno) o sea que quizás yo (Gabriela) poseea 3 repeticiones en el materno y 10 en el paterno. Otra persona podría tener 5 y 15, otra 10 y 12 etc. Cuanto más variable es el numero de repeticiones, más precisa es la técnica. De este tipo de repeticiones se amplifican por PCR varias distintas (localizadas en distintas regiones del genoma) 9 a 13 en cada individuo y los fragmentos se ven luego en geles y se separan por tamaños. El esquema de abajo muestra un ejemplo con sólo 3 repeticiones en el Individuo A, B y C. El tamaño de la banda de lo amplificado varía según el No de repeticiones que cada persona tenga. Otros tipos son los STRs (short tandem repeats o repeticiones cortas en tandem de 2 a 6 pb de longitud que se repiten) Por ejemplo GCGA.GCGA.GCGA etc

Otro ejemplo se ve en la siguiente imágen

Usos en la criminología o medicina forense en este caso con Southern blot y RFLP

 

Otros ejemplos de usos en test de paternidad se ven en la siguiente imagen.

Les dejo finalmente una clase en inglés sobre el tema pero pueden usar los títulos en español.

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Curso de Genética Molecular