TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Francis Crick in his office. Behind him is a model of the human brain that he inherited from Jacob Bronowski. (Photo credit: Wikipedia)

¿A qué se denominan técnicas de biología molecular?

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment length polymorphism), que significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Aqui les dejo para que vean como se hace una extracción de ADN en forma casera. Hagan click aquí

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.

La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

¿Como visualizamos el ADN?

Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.

Para eso debemos preparar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras para que queden sumergidas en el gel y este en un buffer o solución tampón conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica. De esta forma el ADN migra al polo positivo (ya que tiene carga negativa). Los fragmentos muy pequeños migran muy rápido en cambio los más grandes migran más lentamente, permaneciendo cerca del pocillo donde se depositaron. El ADN previamente o el gel deben ser teñidos con bromuro de etidio, que es un colorante naranja que emite ese color solo bajo luz UV. Como se intercala entre los nucléotidos del ADN, el fragmento de ADN se verá naranja.

En el siguiente video se muestra como se realiza un gel de agarosa

La genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crickcontinúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.

Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su practicidad y rapidez para amplificar una región de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis. Para saber si la PCR ha resultado, se colocan las muestras en pocillos de geles de agarosa, teñidos con bromuro de etidio (color naranja)

La técnica se describe en los videos que les dejo abajo

Para reírse un rato les dejo un video divertido llamado  “La canción de la PCR” de una empresa (BIORAD) que vende los termocicladores o Máquinas para automatizar la técnica para hacer PCR

La secuenciación o forma de determinar el orden de los nucléotidos en el ADN de cada cromosoma fue descubierta por Sanger

Gracias a este descubrimiento fueron posibles el uso de muchas técnicas para realizar tanto la secuenciación completa del genoma humano como el de muchos animales domésticos y ademas usar la secuenciaciónque hoy en día es automática y realizada por un secuenciador en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los secuenciadores es el fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la realización de test de paternidad como identificación de criminales. En las primeras épocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por Sir Alec Jeffries y se realizaba por Southernblot, técnica denominada así en honor a su descubridor llamado de apellido Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para la identificación de fragmentos de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al ADN de un gel de agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda marcada radioactivamente. Luego llegaron el northern (para detectar ARN) y el western para detectar fragmentos de ARN proteínas respectivamente.

La forma de llevar a cabo esta técnica se puede ver en el siguiente video

Método de Secuenciación descrito por Sanger y basado en el freno de la síntesis de ADN cuando se usan dideoxinucleótidos en vez de desoxiribonucleótidos. Parte de eso se explica en el video que les dejo abajo

Principios de fingerprint o identificación de huellas de ADN derivada de la primera técnica descrita por Sir Alec Jeffries.

Secuenciación basada en metodo de Sanger pero ahora realizada por un secuenciador automático.

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