Detectives moleculares de alimentos. Ejercitación resuelta

Introducción: Las aplicaciones de la técnica de PCR en el control de alimentos son numerosas. Se pueden utilizar para identificar especies cárnicas y especies de pescado de interés alimenticio, detectar la presencia de agentes patógenos en los alimentos (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7) o detectar la presencia o ausencia de organismos genéticamente modificados (OGMs) en los alimentos.

En la siguiente figura se muestra el resultado obtenido al amplificar por PCR un gen universal presente en todas las especies animales. En este ensayo, cada especie genera una banda de amplificación de un tamaño determinado.

En la Figura 1 puede observar que las calles control (1 a 6) correspondientes a cabra, pollo, vaca, oveja, cerdo y caballo pueden compararse con las muestras problema (calles 7 a 12). Las calles 7 a 12 corresponden a distintos alimentos, en los cuales se quiere determinar qué tipo de carne poseen.

gel agarosa

Teniendo en cuenta el tamaño relativo de los genes amplificados en las muestras control, ¿podría decir qué producto animal poseen los alimentos A (calles 7 y 8), B (calles 9 y 10) y C (calles 11 y 12)?

ACTIVIDAD RESUELTA

Respuestas:  Al comparar los tamaños alélicos, se puede concluir que:

  • La muestra A (calles 7 y 8) contiene pollo,
  • La muestra B (calles 9 y 10) contiene en su composición carne de pollo, vaca y cerdo.
  • La muestra C (calles 11 y 12), al igual que la muestra A, contiene sólo carne de pollo.
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Análisis de marcadores moleculares microsatélites. Ejercitación resuelta

Se propone observar el esquema de la Figura 1 y responder las preguntas.

  1. ¿Qué característica tiene el marcador molecular, que hace que sea considerado un VNTR?
  2. ¿Qué técnica permite amplificar la región VNTR?
  3. ¿Qué significan los segmentos lineares rojos y las flechas contiguas a la región VNTR?
  4. ¿Qué técnica permite discriminar o diferenciar los fragmentos amplificados que poseen distinto tamaño? ¿A qué se deben las diferencias en los tamaños de dichos fragmentos de ADN?
  5. En el esquema del gel, ¿cuántas muestras de ADN de diferentes individuos se han incluido en el análisis?
  6. ¿cuántos alelos hay en este conjunto de 5 individuos? ¿Cuál es el de mayor tamaño? ¿Y el de menor?
  7. ¿Cuál es el número máximo de alelos que puede tener un individuo diploide? Describir qué individuos son homocigotas o heterocigotas y qué alelos poseen.
esquema VNTR

Esquema de un VNTR o microsatélite. Fuente: Porque biotecnología

 

ACTIVIDAD RESUELTA

  1. Las lineas rojas adyacentes a la región del microsatélite, representa a la cadena de ADN que lo rodea. Esta secuencia de ADN debe conocerse para poder diseñar los primers (segmentos de ADN de simple cadena, señalados con flechas rojas en el esquema) complementarios a dicha secuencia. Los primers a derecha e izquierda del microsatélite determinarán los extremos de la región del ADN del que se obtendrán millones de copias luego de realizar la PCR.



  2. La diferencia en tamaño de los fragmentos de ADN está dada por el diferente número de repeticiones de las secuencias en tandem. A cada fragmento de diferente tamaño se lo llama alelo. Por ejemplo, en el esquema se muestra un alelo de 10 repeticiones. Se debe tener en cuenta que en individuos dipolides (2n), en cada locus, se encuentran 2 regiones microsatélites (una en cada cromosoma homólogo). Si el individuo posee dos microsatélites del mismo tamaño, se lo considera homocigota para ese locus, si en cambio las regiones microsatélites en los dos cromosomas homólogos son diferentes, el individuo es heterocigoto para ese locus. Una manera de separar los fragmentos (alelos) de diferente tamaño, es por medio de electroforesis en geles (de agarosa o acrilamida). El ADN, que tiene carga neta negativa, migrará hacia el polo positivo del campo eléctrico creado a través del gel. Debido a la porosidad de dichos geles, las moléculas más grandes (alelos con mayor número de repeticiones) quedarán retrazadas en el gel y correrán menos (más cerca del polo negativo), mientras que las más pequeñas se desplazarán más.


  3. Se incluyeron ADNs de 5 individuos, en los cuales se realizó previamente la PCR, para amplificar la región microsatélite.

  4. Hay 3 alelos de diferentes tamaños (indicados como alelos A, B y C). El alelo de mayor tamaño es el A (corre menos en el gel), mientras que el de menor tamaño es el C.

  5. Un individuo diploide posee 2 alelos. Si los dos alelos son del mismo tamaño (se ven como una única banda en el gel) se dice que es homocigota, mientras que si los dos alelos son diferentes, es heterocigota para ese locus.

  6. Individuo 1: homocigota, posee 2 alelos iguales (B); indiv. 2: heterocigota con los alelos B y C; indiv. 3: homocigota, con el alelo A; indiv. 4: homocigota para el alelo C; indiv. 5: heterocigota, con los alelos A y B.

  7. Un individuo diploide posee 2 alelos. Si los dos alelos son del mismo tamaño (se ven como una única banda en el gel) se dice que es homocigota, mientras que si los dos alelos son diferentes, es heterocigota para ese locus. Individuo 1: homocigota, posee 2 alelos iguales (B); Individuo 2: heterocigota con los alelos B y C; Individuo 3: homocigota, con el alelo A; Individuo 4: homocigota para el alelo C; Individuo 5: heterocigota, con los alelos A y B.

Síndrome overo letal blanco (OLWS). Monografía de alumnos Genética Básica

Fuente: https://www.facebook.com/SobreCaballos/photos/a.481816315195221.107974.479648582078661/1066990530011127/?type=3&theater

Nuevamente quiero dejarles una monografía realizada por dos de mis alumnos de Genética Básica 2017, en este caso Shaira Fernández y Emilio Torres, sobre una enfermedad hereditaria en caballos, el Síndrome Overo Letal Blanco, también conocido como OLWS. Felicitaciones por el trabajo y espero ayude a muchos otros que buscan información sobre el tema.

Tema: Monografía de enfermedad genética hereditaria

Autores: Shaira Fernández – Emilio Torres

Año: 2017

Docentes: Gabriela Iglesias – María Pía Beker

Carrera: Medicina Veterinaria

Materia: Genética Básica

Universidad Nacional de Rio Negro- Sede Alto Valle y Valle Medio (AVVM)

Introducción:

Los objetivos del presente trabajo son profundizar conocimientos genéticos sobre el síndrome overo letal blanco en caballos de la raza Cuarto de Milla Americana principalmente y otras como pintados, caballos miniatura, árabes y occidentales.

El síndrome del potro blanco letal overo se conoce como aganglionosis ileocolica y está directamente relacionado con el gen EDNRB ubicado en el cromosoma 17.

Los patrones de overo blanco son causados por un solo gen (dominante) por lo contrario los caballos con dos copias del gen (recesivo) nacen completamente blancos, (Horse: University of Minnesota Extension, 2017) causando la muerte de los potrillos poco después del nacimiento debido a defectos en el desarrollo embriológico de este, alterando la migración de las células de la cresta neural, las células progenitoras de los melanocitos y ganglios intestinales. (Horse Genome Project, 2017)

Se han descubierto similitudes entre el gen O y el gen que causa la enfermedad de Hirschsprung en humanos. La mutación esta en un lugar diferente en el gen pero causa los mismos efectos: manchas blancas y defectos del desarrollo. (Horse: University of Minnesota Extension, 2017)

Contenido:  

En los caballos hay 32 pares de cromosomas, cada célula del cuerpo de un caballo contiene dos copias de cada cromosoma, una de la madre y otra del padre. (Horse Genetics,2017). El alelo overo muestra pleíotropia que significa que tiene más de un efecto sobre el fenotipo. (Horse Genetics, 2017)

Los potrillos nacen con ojos azules y una bata blanca, y pueden tener pequeñas manchas negras a lo largo de la cabeza, cola y melena. Luego de un tiempo comienzan con cólicos debido a que no pueden defecar, a causa de un mal desarrollo del sistema nervioso gastrointestinal. Las células embrionarias encargadas de formar los nervios mencionados anteriormente también determinan el color de piel. (Horse: University of Minnesota Extension, 2017)

La mutación que causa esta patología es una sustitución de sentido erróneo, que provoca el cambio de lisina por isoleucina, esto ocurre en el codón 118 del receptor de la endotelina B (EDNRB) que está localizado en el cromosoma 17. (Universidad de California Santa Cruz, 2008). Esta proteína está asociada a la regulación del desarrollo de las células de la cresta neural que se convierten en ganglios entéricos y melanocitos. (Santschi, 1998)

Cabe destacar que la sustitución ocurre en el primer dominio transmembrana de un receptor acoplado a la proteína G de 7 dominios transmembrana para las endotelinas. (Baynash et al., 1994; Hosoda et al., 1994).

Características propias del gen:

Gen: EDNRB

Titulo: receptor de endotelina tipo B

Mutación: ocurre en codón 118 de EDNRB

Localización: cromosoma 17

Recuento de exones: 8

Longitud: 24,536 pares de bases (bp)

Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017).

Mutación del ADN: NM 001081837.1:c.353_354delinsAG

Efecto previsto de la mutación: Interrupción de aminoácidos (isoleucina 118 por lisina)

Fuente: Bellone, R. (2010).

figura 1 corregida

Figura 1: Secuencia gen EDNRB. Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017).

figura 2

Figura 2: Gen endotelina B. Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017)

Diagnóstico :

PCR especifica de alelo, es una de las variaciones de la PCR básica que se usa para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). Se utilizan primers específicos para la secuencia normal y mutante. El diseño más habitual de esta técnica es un análisis en dos tubos con dos primers: uno normal y otro mutante en reacciones separadas junto con los primers control. (Reacción en cadena de la polimerasa. Es.wikipedia.org, 2017)

La reacción de cadena en la polimerasa (PCR) alelo especifica es la técnica de genética molecular utilizada para identificar a los caballos reproductores en riesgo de transmitir el gen letal a sus descendientes.  Para analizar el ADN se extrae sangre o muestras de cabello con raíces. (Horse Genetic ,2017).

Esta técnica permite amplificar el ADN, produciendo cantidades relativamente grandes para analizar su secuencia génica, expresión génica. Los materiales para llevar a cabo la reacción vienen incluidos en un KIT con uno o más cebadores de oligonucleótidos (cadenas cortas de nucleótidos), tampón de reacción de PCR, enzima de ADN polimerasa, materiales de análisis de electroforesis en gel e instrucciones para llevar a cabo reacciones de PCR. (Metallinos et al. 2002)

Descripción de la técnica:

En este caso es un método para identificar un gen del receptor de endotelina B de tipo salvaje y la mutación, amplificando una porción del gen del receptor de endotelina B de una muestra biológica de caballo usando cebadores/primers denominados SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 en reacciones de amplificación en las que da como resultado la generación de polinucleótidos de 174, 105 y 90 bp. (Metaliinos et al. 2002).

figura 3 primers

Figura 3: grupo de primers que se utilizaron para llevar a cabo la técnica PCR alelo específica. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens

La Figura 4 muestra la orientación y posición de los cebadores usados en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la mutación de dos pares de bases asociada con el Síndrome Overo Letal Blanco. Las flechas indican el extremo 3 ‘ de cada cebador. El recuadro alrededor de las bases TC-AG, muestra la diferencia de secuencia de dos pares de bases entre el caballo de tipo salvaje y el ADN de caballo blanco letal.

figura-4.jpg

Figura 4: Esquema de la secuencia y los primers u oligonucleótidos usados para la amplificación en una PCR alelo específica. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens.

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Figura 5: muestra los resultados de una reacción de PCR realizada en un gel de poliacrilamida al 12% y teñida con bromuro de etidio. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene and Gene Products The Lens

En la Figura 5 observamos el carril 1 que es el producto de PCR de una muestra de caballo heterocigota; el carril 2 es el producto de PCR de la muestra de caballo de potro blanco letal y el carril 3 es el producto de PCR de una muestra homocigótica de caballo salvaje.
Se puede observar que cada carril tiene el control de 174 pares de bases para la reacción de PCR resultante de la amplificación con los cebadores E1.F y E1.R. Los carriles 1 y 2 tienen el producto específico blanco letal de 105 pares de bases resultante de la amplificación con los primers lw2. F y E1.R. Los carriles 1 y 3 tienen el producto específico de tipo salvaje de 90 pares de bases resultante de la amplificación con los cebadores wt2.F y E1-2.F.
( Patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens).
En conclusión se puede distinguir un producto del alelo blanco letal de 105 pb y alelo tipo salvaje de 90 pb. Por lo tanto los portadores del alelo del potro letal blanco pueden identificarse fácilmente por PCR.

Aplicaciones más importantes de esta técnica: detectar alelos de un gen normal y mutado (enfermedades hereditarias), portadores (individuos que presentan un fenotipo normal, pero son capaces de transmitir a su descendencia un carácter indeseable que los predispone a padecer una patología). Por lo general este carácter sigue un modelo de herencia simple recesiva, de tal modo que solo las homocigotas recesivas presentan el fenotipo indeseable. (Técnicas de biología molecular, 2008)

Modo de transmisión a la descendencia:

La herencia del gen se caracteriza por ser:

  • Autosómica recesiva
  • Expresividad variable
  • Es Letal
  • Penetrancia incompleta

Fuente: (the “genetics”of beeding horse journals, 2013).

capture-20171120-204132

Figura 6: Esquema de modo de herencia del gen overo letal blanco. Fuente: (Santschi et al.,1998)

El apareamiento de dos overos heterocigotos dará como resultado promedio un 25 % de potros con el gen letal overo blanco, esto quiere decir que hay una probabilidad de 1 en 4 de que nazca un overo blanco letal, los demás descendientes serán overos de color sólido o heterocigotos.

Los potros afectados son homocigotos para el gen Lys (Lys 118/Lys 118) y los portadores son heterocigotos (Ile 118/Lys 118).

La incidencia de heterocigotos OLWS es muy alta, mas de 94% en caballos marco overo muy blanco y mezclas de marco overo. Un 21% de incidencia de heterocigotos OLWS blancos con patrones de color incluyen al tobiano, sabino. (Santschi et al; 2001).

Se recomienda cruzar caballos sólidos con overos que dan como resultado potros sólidos y overos en igual número sin aparecer potros con el gen letal. Ocasionalmente los caballos sin patrones apreciables de manchas corporales han engendrado potros con LWO (letal White overo) incluida la raza cuarto de milla. Algunos caballos que llevan el gen overo letal blanco pueden tener poco o ningún color blanco en ellos. (lethal white overo horses, 2017)

Debido a esto no se puede deducir el genotipo necesariamente a partir del color del pelaje. (Metallinos et al., 1998)

Prevención y control:

  • Principalmente un diagnostico PCR  dirigido a todos los overos de cuadro y sus descendientes.
  • Pelajes similares como: tobiano, pintado.
  • Prevención en la adquisición de un ejemplar equino

Conclusión:

Concluimos que conocer la genética del caballo nos sirve para su mejoramiento ya que los genes son como si fueran piezas de un código que indica cómo se va a construir molecularmente un organismo y su funcionamiento. Además debemos recordar que los trastornos genéticos van a ser heredados y que a simple vista no podemos diagnosticarlos ya que los pelajes pueden resultar engañosos, para ello es necesario conocer el árbol genealógico del animal o realizar una técnica de diagnostico molecular (PCR),  la cual está a nuestro alcance en Argentina solo que debemos mandar a sintetizar los primers específicos y contar con la infraestructura necesaria para realizarlo.

A lo largo de esta investigación podemos afirmar que el síndrome overo letal blanco es una enfermedad genética a tener en cuenta sobre todo en caballos de la raza cuarto de milla, pese a las excepciones ya nombradas en otras razas, siendo de pronóstico grave y sin tratamiento que termina en la muerte del potrillo entre las 12-24 horas aproximadamente luego de su nacimiento.  Si bien la bibliografía nos lleva a casos de otros países debemos prever la posibilidad de que suceda en Argentina y saber actuar al respecto.

Con estas herramientas de diagnostico podemos proveer información acerca del gen letal para criadores y haras con el fin de prevenir el nacimiento indeseado de potrillos con este síndrome y además a las personas dispuestas a adquirir un ejemplar. Como parte de nuestra formación en medicina veterinaria creemos imprescindible el asesoramiento para evitar pérdidas.

Bibliografía:

·         Horse Genome Project. (2017). Uky.edu. Retrieved 24 October 2017, from http://www.uky.edu/Ag/Horsemap/

·         Finno, C., Spier, S., & Valberg, S. (2009), Equine diseases caused by known genetic mutatios. The Veterinary Journal, 179(3), 336-347.doi:10.1016/j.tvjl.2008.03.016

·         Santschi, E., Purdy, A., Valberg, S., Vrotsos, P., Kaese, H., & Mickelson, J. (1998). Endothelin receptor B polymorphism associated with lethal white foal syndrome in horses. Mammalian Genome, 9(4), 306-309. doi:10.1007/s003359900754

·         Lethal white overo horses. (2017). Horse-genetics.com. Retrieved 24 October 2017, from http://www.horse-genetics.com/overo-horses-LWO.html (Overo lethal white syndrome (OLWS) : Horse : University of Minnesota Extension
·         Overo lethal white syndrome (OLWS) : Horse : University of Minnesota Extension. (2017). Extension.umn.edu. Retrieved 24 October 2017, from https://www.extension.umn.edu/agricult)
·         Horse Genome Project. (2017). Uky.edu. Retrieved 24 October 2017, from http://www.uky.edu/Ag/Horsemap/hgpd
·         lethal white overo horses. (2017). Horse-genetics.com. Retrieved 24 October 2017, from http://www.horse-genetics.com/overo-horses-LWO.html
·         (Overo lethal white syndrome (OLWS) : Horse : University of Minnesota Extension (2017). Extension.umn.edu. Retrieved 24 October 2017, from https://www.extension.umn.edu/agricult
·         TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. (2008). Desde Mendel hasta las moléculas
·         Patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens. (2017). The Lens.
·         EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017). Ncbi.nlm.nih.gov
·         Bellone, R. (2010). Pleiotropic effects of pigmentation genes in horses. Animal Genetics, 41(s2), 100-110.
·         Danika Metallinos, Portola Valley, California (EE. UU.); Jasper Rine , Moraga, California (EE. UU.); y Ann Bowling, Davis, California (EE. UU.), 2002

Síndrome overo letal blanco. Monografía de alumnos Genética Básica

Nuevamente quiero dejarles una monografía realizada por dos de mis alumnos de Genética Básica 2017, en este caso Shaira Fernández y Emilio Torres, sobre una enfermedad hereditaria en caballos, el Síndrome Overo Letal Blanco, también conocido como OLWS. Felicitaciones por el trabajo y espero ayude a muchos otros que buscan información sobre el tema.

Tema: Monografía de enfermedad genética hereditaria

Autores: Shaira Fernández – Emilio Torres

Año: 2017

Docentes: Gabriela Iglesias – María Pía Beker

Carrera: Medicina Veterinaria

Materia: Genética Básica

Universidad Nacional de Rio Negro- Sede Alto Valle y Valle Medio (AVVM)

Introducción:

Los objetivos del presente trabajo son profundizar conocimientos genéticos sobre el síndrome overo letal blanco en caballos de la raza Cuarto de Milla Americana principalmente y otras como pintados, caballos miniatura, árabes y occidentales.

El síndrome del potro blanco letal overo se conoce como aganglionosis ileocolica y está directamente relacionado con el gen EDNRB ubicado en el cromosoma 17.

Los patrones de overo blanco son causados por un solo gen (dominante) por lo contrario los caballos con dos copias del gen (recesivo) nacen completamente blancos, (Horse: University of Minnesota Extension, 2017) causando la muerte de los potrillos poco después del nacimiento debido a defectos en el desarrollo embriológico de este, alterando la migración de las células de la cresta neural, las células progenitoras de los melanocitos y ganglios intestinales. (Horse Genome Project, 2017)

Se han descubierto similitudes entre el gen O y el gen que causa la enfermedad de Hirschsprung en humanos. La mutación esta en un lugar diferente en el gen pero causa los mismos efectos: manchas blancas y defectos del desarrollo. (Horse: University of Minnesota Extension, 2017)

Contenido:  

En los caballos hay 32 pares de cromosomas, cada célula del cuerpo de un caballo contiene dos copias de cada cromosoma, una de la madre y otra del padre. (Horse Genetics,2017). El alelo overo muestra pleíotropia que significa que tiene más de un efecto sobre el fenotipo. (Horse Genetics, 2017)

Los potrillos nacen con ojos azules y una bata blanca, y pueden tener pequeñas manchas negras a lo largo de la cabeza, cola y melena. Luego de un tiempo comienzan con cólicos debido a que no pueden defecar, a causa de un mal desarrollo del sistema nervioso gastrointestinal. Las células embrionarias encargadas de formar los nervios mencionados anteriormente también determinan el color de piel. (Horse: University of Minnesota Extension, 2017)

La mutación que causa esta patología es una sustitución de sentido erróneo, que provoca el cambio de lisina por isoleucina, esto ocurre en el codón 118 del receptor de la endotelina B (EDNRB) que está localizado en el cromosoma 17. (Universidad de California Santa Cruz, 2008). Esta proteína está asociada a la regulación del desarrollo de las células de la cresta neural que se convierten en ganglios entéricos y melanocitos. (Santschi, 1998)

Cabe destacar que la sustitución ocurre en el primer dominio transmembrana de un receptor acoplado a la proteína G de 7 dominios transmembrana para las endotelinas. (Baynash et al., 1994; Hosoda et al., 1994).

Características propias del gen:

Gen: EDNRB

Titulo: receptor de endotelina tipo B

Mutación: ocurre en codón 118 de EDNRB

Localización: cromosoma 17

Recuento de exones: 8

Longitud: 24,536 pares de bases (bp)

Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017).

Mutación del ADN: NM 001081837.1:c.353_354delinsAG

Efecto previsto de la mutación: Interrupción de aminoácidos (isoleucina 118 por lisina)

Fuente: Bellone, R. (2010).

figura 1 corregida
Figura 1: Secuencia gen EDNRB. Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017).
figura 2
Figura 2: Gen endotelina B. Fuente: EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017)

Diagnóstico :

PCR especifica de alelo, es una de las variaciones de la PCR básica que se usa para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). Se utilizan primers específicos para la secuencia normal y mutante. El diseño más habitual de esta técnica es un análisis en dos tubos con dos primers: uno normal y otro mutante en reacciones separadas junto con los primers control. (Reacción en cadena de la polimerasa. Es.wikipedia.org, 2017)

La reacción de cadena en la polimerasa (PCR) alelo especifica es la técnica de genética molecular utilizada para identificar a los caballos reproductores en riesgo de transmitir el gen letal a sus descendientes.  Para analizar el ADN se extrae sangre o muestras de cabello con raíces. (Horse Genetic ,2017).

Esta técnica permite amplificar el ADN, produciendo cantidades relativamente grandes para analizar su secuencia génica, expresión génica. Los materiales para llevar a cabo la reacción vienen incluidos en un KIT con uno o más cebadores de oligonucleótidos (cadenas cortas de nucleótidos), tampón de reacción de PCR, enzima de ADN polimerasa, materiales de análisis de electroforesis en gel e instrucciones para llevar a cabo reacciones de PCR. (Metallinos et al. 2002)

Descripción de la técnica:

En este caso es un método para identificar un gen del receptor de endotelina B de tipo salvaje y la mutación, amplificando una porción del gen del receptor de endotelina B de una muestra biológica de caballo usando cebadores/primers denominados SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 en reacciones de amplificación en las que da como resultado la generación de polinucleótidos de 174, 105 y 90 bp. (Metaliinos et al. 2002).

figura 3 primers
Figura 3: grupo de primers que se utilizaron para llevar a cabo la técnica PCR alelo específica. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens

La Figura 4 muestra la orientación y posición de los cebadores usados en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la mutación de dos pares de bases asociada con el Síndrome Overo Letal Blanco. Las flechas indican el extremo 3 ‘ de cada cebador. El recuadro alrededor de las bases TC-AG, muestra la diferencia de secuencia de dos pares de bases entre el caballo de tipo salvaje y el ADN de caballo blanco letal.

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Figura 4: Esquema de la secuencia y los primers u oligonucleótidos usados para la amplificación en una PCR alelo específica. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens.
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Figura 5: muestra los resultados de una reacción de PCR realizada en un gel de poliacrilamida al 12% y teñida con bromuro de etidio. Fuente: patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene and Gene Products The Lens

En la Figura 5 observamos el carril 1 que es el producto de PCR de una muestra de caballo heterocigota; el carril 2 es el producto de PCR de la muestra de caballo de potro blanco letal y el carril 3 es el producto de PCR de una muestra homocigótica de caballo salvaje.
Se puede observar que cada carril tiene el control de 174 pares de bases para la reacción de PCR resultante de la amplificación con los cebadores E1.F y E1.R. Los carriles 1 y 2 tienen el producto específico blanco letal de 105 pares de bases resultante de la amplificación con los primers lw2. F y E1.R. Los carriles 1 y 3 tienen el producto específico de tipo salvaje de 90 pares de bases resultante de la amplificación con los cebadores wt2.F y E1-2.F.
( Patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens).
En conclusión se puede distinguir un producto del alelo blanco letal de 105 pb y alelo tipo salvaje de 90 pb. Por lo tanto los portadores del alelo del potro letal blanco pueden identificarse fácilmente por PCR.

Aplicaciones más importantes de esta técnica: detectar alelos de un gen normal y mutado (enfermedades hereditarias), portadores (individuos que presentan un fenotipo normal, pero son capaces de transmitir a su descendencia un carácter indeseable que los predispone a padecer una patología). Por lo general este carácter sigue un modelo de herencia simple recesiva, de tal modo que solo las homocigotas recesivas presentan el fenotipo indeseable. (Técnicas de biología molecular, 2008)

Modo de transmisión a la descendencia:

La herencia del gen se caracteriza por ser:

  • Autosómica recesiva
  • Expresividad variable
  • Es Letal
  • Penetrancia incompleta

Fuente: (the “genetics”of beeding horse journals, 2013).

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Figura 6: Esquema de modo de herencia del gen overo letal blanco. Fuente: (Santschi et al.,1998)

El apareamiento de dos overos heterocigotos dará como resultado promedio un 25 % de potros con el gen letal overo blanco, esto quiere decir que hay una probabilidad de 1 en 4 de que nazca un overo blanco letal, los demás descendientes serán overos de color sólido o heterocigotos.

Los potros afectados son homocigotos para el gen Lys (Lys 118/Lys 118) y los portadores son heterocigotos (Ile 118/Lys 118).

La incidencia de heterocigotos OLWS es muy alta, mas de 94% en caballos marco overo muy blanco y mezclas de marco overo. Un 21% de incidencia de heterocigotos OLWS blancos con patrones de color incluyen al tobiano, sabino. (Santschi et al; 2001).

Se recomienda cruzar caballos sólidos con overos que dan como resultado potros sólidos y overos en igual número sin aparecer potros con el gen letal. Ocasionalmente los caballos sin patrones apreciables de manchas corporales han engendrado potros con LWO (letal White overo) incluida la raza cuarto de milla. Algunos caballos que llevan el gen overo letal blanco pueden tener poco o ningún color blanco en ellos. (lethal white overo horses, 2017)

Debido a esto no se puede deducir el genotipo necesariamente a partir del color del pelaje. (Metallinos et al., 1998)

Prevención y control:

  • Principalmente un diagnostico PCR  dirigido a todos los overos de cuadro y sus descendientes.
  • Pelajes similares como: tobiano, pintado.
  • Prevención en la adquisición de un ejemplar equino

Conclusión:

Concluimos que conocer la genética del caballo nos sirve para su mejoramiento ya que los genes son como si fueran piezas de un código que indica cómo se va a construir molecularmente un organismo y su funcionamiento. Además debemos recordar que los trastornos genéticos van a ser heredados y que a simple vista no podemos diagnosticarlos ya que los pelajes pueden resultar engañosos, para ello es necesario conocer el árbol genealógico del animal o realizar una técnica de diagnostico molecular (PCR),  la cual está a nuestro alcance en Argentina solo que debemos mandar a sintetizar los primers específicos y contar con la infraestructura necesaria para realizarlo.

A lo largo de esta investigación podemos afirmar que el síndrome overo letal blanco es una enfermedad genética a tener en cuenta sobre todo en caballos de la raza cuarto de milla, pese a las excepciones ya nombradas en otras razas, siendo de pronóstico grave y sin tratamiento que termina en la muerte del potrillo entre las 12-24 horas aproximadamente luego de su nacimiento.  Si bien la bibliografía nos lleva a casos de otros países debemos prever la posibilidad de que suceda en Argentina y saber actuar al respecto.

Con estas herramientas de diagnostico podemos proveer información acerca del gen letal para criadores y haras con el fin de prevenir el nacimiento indeseado de potrillos con este síndrome y además a las personas dispuestas a adquirir un ejemplar. Como parte de nuestra formación en medicina veterinaria creemos imprescindible el asesoramiento para evitar pérdidas.

Bibliografía:

·         Horse Genome Project. (2017). Uky.edu. Retrieved 24 October 2017, from http://www.uky.edu/Ag/Horsemap/

·         Finno, C., Spier, S., & Valberg, S. (2009), Equine diseases caused by known genetic mutatios. The Veterinary Journal, 179(3), 336-347.doi:10.1016/j.tvjl.2008.03.016

·         Santschi, E., Purdy, A., Valberg, S., Vrotsos, P., Kaese, H., & Mickelson, J. (1998). Endothelin receptor B polymorphism associated with lethal white foal syndrome in horses. Mammalian Genome, 9(4), 306-309. doi:10.1007/s003359900754

·         Lethal white overo horses. (2017). Horse-genetics.com. Retrieved 24 October 2017, from http://www.horse-genetics.com/overo-horses-LWO.html (Overo lethal white syndrome (OLWS) : Horse : University of Minnesota Extension
·         Overo lethal white syndrome (OLWS) : Horse : University of Minnesota Extension. (2017). Extension.umn.edu. Retrieved 24 October 2017, from https://www.extension.umn.edu/agricult)
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·         TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. (2008). Desde Mendel hasta las moléculas
·         Patente US 6372900 B1 – Horse Endothelin-b Receptor Gene And Gene Products The Lens. (2017). The Lens.
·         EDNRB endothelin receptor type B [Equus caballus (horse)] – Gene – NCBI. (2017). Ncbi.nlm.nih.gov
·         Bellone, R. (2010). Pleiotropic effects of pigmentation genes in horses. Animal Genetics, 41(s2), 100-110.
·         Danika Metallinos, Portola Valley, California (EE. UU.); Jasper Rine , Moraga, California (EE. UU.); y Ann Bowling, Davis, California (EE. UU.), 2002

Curso 2016 Genética Básica. Pizarra digital

Hola a todos mis alumnos y bienvenidos al curso de genética Básica de la carrera de Veterinaria de la UNRN.

Les quiero dar la bienvenida y espero que disfrutemos juntos de la aventura de la genética.

Quería en particular dejarles el material con el que vamos a trabajar en el curso. Son dos pizarras digitales, una para la primera parte de la materia y otra para la segunda.

Se las dejo a ambas en este sitio para que puedan acceder todas las veces que sea necesario, imprimir o leer online, tanto las clases, como ver los videos o leer la bibliografía y/0 sitios recomendados. Recuerden que para descargar el materia debe poner (ver original)

Saludos

Espero les sirva y nos vemos en las clases

 

1ra parte

https://padlet.com/embed/k6qhwtzpa0

Link directo a la pizarra: https://padlet.com/chickmhc/k6qhwtzpa0

 

2da parte

 

Link directo ala pizarra: https://padlet.com/chickmhc/a4un2yrmeh

 

 

Saludos

Gaby

Enfermedad renal poliquistica, conocida con las siglas PKD (Polycystic Kidney Disease)

images (1)Nuevamente quiero dejarles una monografía realizada por uno de mis alumnos, en este caso Rocío Vega sobre Enfermedad poliquística renal en felinos. Felicitaciones por el trabajo y espero ayude a muchos otros que buscan infromación sobre el tema

 

ENFERMEDAD POLIQUITISCA

RENAL EN FELINOS

Alumno/a: Vega I. Rocío.

Año: 3°.

Curso: GenéticaBásica.

Profesor/a: Gabriela M. Iglesias.

Universidad: Universidad Nacional de Rio Negro. Sede Valle Medio.

 

INTRODUCCION

En la siguiente monografía se tratara la enfermedad renal poliquistica, conocida con las siglas PKD (Polycystic Kidney Disease) también llamado enfermedad poliquistica renal felina, autosómica dominante, que es la enfermedad genética hereditaria más frecuente en gatos persas, exótico cruzas de esta raza. Afecta principalmente los riñones del gato y aqueja al 37% de la población felina mundial. Consiste en la aparición de pequeños quistes en la corteza renal, que aumentan de tamaño con la edad a medida que se rellena de orina provocando la aparición de insuficiencia renal irreversible, aparece asimismo en el hígado y páncreas ocasionalmente.Actualmente, la PKD  se considera una importante causa de insuficiencia renal que podría afectar a la tercera parte de la población mundial de gatos lo que hace que esta enfermedad sea unas de las de mayor prevalencia dentro de las dolencias hereditarias de los felinos (Ferreira; 2010)

 

 

DESARROLLO

Las primeras referencias de la presencia de esta enfermedad en el gato son de hace 30 años pero los estudios específicos no se empezaron a desarrollar hasta 1990. Actualmente se sabe que es una enfermedad hereditaria y codificada por un gen autosómico dominante. Esto quiere decir que se transmite de padres a hijos a través de los cromosomas no sexuales, no es una enfermedad ligada al sexo (Ya-Jane Lee; 2010).

 

La ERP se caracteriza por la presencia de quistes de tamaño variable que pueden estar ubicados en la corteza o en la médula renal y ocasionalmente en otros órganos como el hígado, páncreas y bazo. Presenta un carácter hereditario autosómico dominante y por ello no existe predisposición ligada al sexo. Aunque en el gato los quistes pueden aparecer en animales jóvenes, las manifestaciones clínicas de la enfermedad no aparecen generalmente antes de la edad adulta (Ferreira; 2010).

Es una enfermedad hereditaria de tipo autosómico dominante causada por una mutación puntual del gen PKD1, situado en el cromosoma 18 exón 29 (E3), donde una adenina es sustituida por una citosina en la posición 3284, generándose de esta manera un codón de stop que como consecuencia resulta en la pérdida del 25 % de la proteína C-terminal y que da la formación de una proteína anómala, la policistina, que será la responsable directa de la formación de quistes.

 

 

El carácter hereditario autosómico dominante está relacionado con dos tipos de genes. El gen P que representa la forma dominante y el gen p que representa la forma recesiva. Cada individuo posee dos genes en el locus para ERP: un materno y un paterno. De esta forma, los genes pueden proveer tres combinaciones que son: PP como forma genotípica de homocigoto positivo y fenotípico positiva (el animal padece la enfermedad), Pp como forma genotípica de heterocigotos positivos y fenotípica positiva (el animal presenta la enfermedad), y pp como forma genotípica de homocigotos negativo y fenotípica negativa (el animal no padece la enfermedad). Los animales homocigotos dominantes (PP) queposeen un gen ERP proveniente del padre y otro de la madre no sobreviven, estos animales poseen una forma grave y letal de la enfermedad con muerte antes del nacimiento a una edad temprana, es decir los gatos homocigotas dominantes (PP) mueren en el útero materno. Los padres genéticamente recesivos y negativos (pp) para ERP no pueden producir en su descendencia gatos positivos, a menos que haya una mutación genética. Por tanto, todos los gatos afectados son heterocigotos (Pp), van a desarrollan la enfermedad entre los 5- 7 años.

De esta manera el cruzamiento de dos gatos negativos, homocigotos recesivos (pp), resulta en gatos sanos. El cruzamiento de un gato sano (homocigoto recesivo) con un gato afectado (heterocigotoPp) tiene una probabilidad del 50% de que los gatos sean sanos y la otra mitad sean gatos afectados. El cruzamiento de dos gatos con ERP (heterocigotoPp) puede provocar estadísticamente un 75% de gatos afectados con la enfermedad y el 25% de gatos sanos. Entre los gatos afectados, un tercio serán homocigoto-dominantes (Ferreira; 2010).

 

Gato libre: pp Gato heterocigótico: Pp Gato homocigótico: PP

Gato heterocigota Pp X  gato libre pp.

50 % de probabilidad de enfermos.

Gato homocigota PP x gato libre pp.

100 % de enfermos.

Gato heterocigota Pp x gato heterocigota Pp.

75% de probabilidad de enfermos.

Gato homocigota PP x gato homocigota PP.
100% de enfermos.Letal

Gato libre pp x gato libre pp.

100% de libres.

 

Los gatos con ERP son frecuentemente asintomáticos cuando la afección es unilateral y demuestran signos de insuficiencia renal cuando es bilateral.En todo caso, los signos clínicos son variables y se asocian al crecimiento de los quistes y a la presión sobre el parénquima renal periférico al quiste que causa daño progresivo de nefronas. Al ser una enfermedad hereditaria, los quistes están presentes desde el nacimiento del gato, al principio el tamaño del quiste es de menos de 1 milímetro. A medida que el animal se desarrolla y va cumpliendo años, los quistes empiezan a crecer hasta alcanzar varios centímetros hasta 2 centímetros.Los signos suelen aparecer entre los tres y los diez años de edad. Se puede observar letargia, anorexia, vómitos, polidipsia, poliuria, pérdida de peso, hematuria, mucosas pálidas, relacionados con la gravedad de la insuficiencia renal crónica. La hematuria en gatos es probablemente el resultado de hemorragias intra-renales y es similar al que sucede en humanos. A la palpación los riñones estarán alargados e irregulares. (Ferreira; 2010).

Diagnostico

Entre las herramientas para el diagnóstico de la ERP en los gatos se incluyen la anamnesis, el examen clínico, los análisis de sangre y orina, las pruebas genéticas, la ultrasonografía renal, la tomografía computarizada, la urografía excretora y el estudio histológico de biopsias renales. La biopsia renal está contraindicada en presencia de quistes grandes.

 

Pruebas genéticas

Es posible identificar la mutación asociada a la ERP mediante la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinado con un estudio del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).Estos métodos necesitan de una gran cantidad de ADN y de buena calidad. El presente estudio para la identificación del PKD1 se puede desarrollar en una veterinaria que disponga del equipo necesario fácilmente. (Ferreira; 2010).

Para el genotipeo del exón 29 del gen PKD1 por ARMS (amplification refractory mutant system) PCR, se designan dos set de primers para rotular ya sea el alelo mutante o el normal, basado en el punto de mutación de Citosina- Adenina.

La amplificación de los dos alelos (alelo-especifico)  toma lugar en direcciones opuestas y los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden ser fácilmente visualizados en gel agarosa por electroforesis (fig n°2). La discriminación de la amplificación depende principalmente de la falta de coincidencia de nucleótidos en el primer 3´-terminacion. El priming alelo- especifico del proceso del PCR solo permitirá que la amplificación se pueda hacer cuando el 3´- nucleótido terminal concuerde con su secuencia diana. Además se agregó deliberadamente un desajuste adicional en la cuarta parte del último nucleótido, en la posición final del 3´primer para incrementar el rango de discriminación(Fig n°1).  (Ya-Jane Lee; 2010).

Procedimiento de Prueba

Como se muestra en la figura 2  el primer específicos del alelo mutante F3 y R2 amplificó un fragmento de 277 pb sólo de la muestra mutante, mientras que el fragmento de ADN con un tamaño esperado de 189 pb fue amplificado a partir del alelo de tipo salvaje por los cebadores F2 y R3. Como era de esperar, el producto de PCR correspondiente a el alelo normal también se obtuvo de la muestra de ADN que contenía el punto mutante PKD1 porque los gatos con PQRAD son heterocigóticos en el locus de este gen. Estos resultados confirmaron la especificidad de estos set de primers para diferenciar el alelo PKD1 normal del alelo PKD1 mutante que contenía un solo punto de mutación.

A continuación, para simplificar el procedimiento de manejo, para posibilitar  la amplificación simultánea del alelo mutante y normal los productos específicos en 1 tubo se puso a prueba. Cuatro primers: 1 ml de F2, F3, R2, y R3 (10 mM) se incluyeron en 1 reacción (ARMS-tetra primers de PCR) para investigar si porciones de los dos alelos diferentes de PKD1 podrían ser diferencialmente amplificada. Tres productos que representan la amplificación del alelo mutante (227 pb), de la normal alelo (189 pb), y un control interno (429 pb) se esperó que fuesen amplificados en los experimentos (Fig 1b). Como se muestra en la figura 2 barra 5 solo dos productos de PCR de429 pb y 277 pb fueron amplificados por el set de primers externos F2 / R2 y el primer par-alelo mutante F3 / R2. La ausencia del producto 189-bp indicó que el primer normal alelo fallo al ser amplificado. Se hicieron intentos para optimizar la ARMS tetra-primer reacción de PCR, por ejemplo, el ajuste de la temperatura de recocido (68-72°C) y usando diversas concentraciones de primers individuales y de MgCl2(1-5 mM); sin embargo, no se obtuvieron resultados satisfactorios. En consecuencia, un ARMS tri-PCR primers fue desarrollado para superar el problema como se describe a continuación. Según lo informado por otros grupos de investigación, los gatos que se ponen a prueba y dan positivo para el alelo mutante son heterocigotos y, por lo tanto, también tienen un alelo de tipo salvaje. Debido a que tanto gatos normales como afectados PQRAD contienen alelo normal, la detección de la presencia de 1 alelo normal no es crítico para diagnóstico de la PQRAD, siempre y cuando el control interno que rotula otra región del gen de PKD se amplifique con éxito para asegurar que el PCR era funcional. Esto condujo a el desarrollo de una prueba de ARMS PCR que utiliza sólo 3 cebadores (ARMS-triprimers de PCR) y que omite el primer alelo normal- R3 (Fig. 1C). (Ya-Jane Lee; 2010)

PCR polquistica renal

 

Fig n° 1. (Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010)

 

 

PCR 1 Vega

PCR 2

Fig n° 2. (Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010)

 

Se señaló que la prueba genética de PCR-RFLP fue más sensible que la ultrasonografía para detectar la ERP en gatos persas de menos de tres meses de edad.

Los gatos persas y afines a gatos persas deben ser probados para ADPKD (autosomal dominant polycystic kidney disease) antes de la cruza. Incluso cuando los criadores de gatos saben que nunca deben cruzarse animales que posean el gen mutante PKD1, esto sigue ocurriendo por varias razones:

·         Los animales portadores no expresan signos clínicos de ADPKD en la vida temprana.

·         Muchos criadores todavía no son conscientes de la enfermedad y su impacto.

·         La ecografía no está disponible o su costo es muy elevado.

·         La cruza se realiza previo a un diagnóstico preciso.

·         La enfermedad tiene una alta prevalencia, por lo tanto, muchos criaderos podrían perder aproximadamente el 40 % de su población reproductora.

Las pruebas genéticas para ADPKD proporcionan un método preciso y eficiente de la selección de los gatos de cría, y así podría funcionar para eliminar ADPKD del programa de cría (Marcela C. Scalon; 2014).

 

Tratamiento

 

Las opciones de tratamiento están muy limitadas y son de muy mal pronóstico, se debe tratar como un riñón terminal y esto incluye rehidratación y estabilización del paciente, restricción en la dieta de proteínas para evitar la alta producción de metabolitos nitrogenados, disminuir los niveles de urea en el organismo, restricción de fósforo en la alimentación, y suplementación dietética en cuanto sea posible con vitaminas, taurina, potasio, sodio, bicarbonato. Es recomendable proveer al paciente de agua fresca ad libitum. Se debe evitar en lo posible el estrés a estos gatos. El trasplante renal es una opción si se dispone de donante y de la infraestructura necesaria para hacerlo aunque, por regla general, no está a nuestro alcance para gatos con insuficiencia renal crónica por enfermedad renal poliquística (Lorena Millán Varela;).

 

 

CONCLUSION

 

A modo de conclusión se puede decir que esta enfermedad de carácter dominante autosómico que afecta principalmente a los gatos persas y a los felinos producto de la cruza con esta raza, es uno de los mayores problemas para los criadores y propietarios debido al carácter crónico de la enfermedad. Afecta principalmente la funcionalidad del riñón, pero también puede llegar a afectar el páncreas e hígado apareciendo en animales de edad avanzada pero que está presente en el felino desde el momento de su nacimiento. La detección de la enfermedad es simple siendo la ecografía, o exámenes genéticos como el PCR los más comunes y usados. En caso de que el animal de positivo a la enfermedad poliquistica renal se deberá proceder a la esterilización de este y realizar el tratamiento adecuado para garantizarle una buena calidad de vida dentro de las posibilidades de este.

 

BIBLIOGRAFIA

 

·         Ferreira, G.S; Anales de veterinaria de Murcia; 2010. Enfermedad renal poliquística en gatos: Revisión de la literatura. Vol 26. (http://hdl.handle.net/10201/20623).

·         Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010. Molecular Detection of Autosomal-Dominant Feline Polycystic Kidney Disease by Multiplex Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction(http://www.researchgate.net/publication/44583283).

·         Lorena Millán Varela; Facultad de Veterinaria. Universidad de León;Importancia de la Enfermedad Renal Poliquística en el gato Persa. (http://eurhydice.kormak.es/Enfermedades.pdf).

·         Marcela C. Scalon ; Journal of veterinary diagnostic investigation; 2014; Touchdown polymerase chain reaction detection of polycystic kidney disease and laboratory findings in different cat population; (http://vdi.sagepub.com/content/26/4/542).

 

Síndrome del potro lavanda. Monografìas de alumnos

En este ocasión, una de mis alumnas Micaela Tessan desarrolló una monografía de esta enfermedad hereditaria en equinos.

Mis felictaciones a ella y espero les sea útil a muchos.

Saludos

Gaby

 

Alumna: TESAN, Micaela Yanina

UNRN

Cátedra: Genética Básica

Fecha de entrega: 9/11/2015

Profesora: IGLESIAS, Gabriela

 

“Síndrome del potro lavanda”

La siguiente monografía se realiza dentro del marco de la carrera de Medicina Veterinaria, para la cátedra de Genética Básica, con el objetivo informar la investigación sobre el tema: Síndrome del potro lavanda (EPA). Es un trabajo en el que se expone en forma explícita las características y datos de una enfermedad genética, a partir de la investigación de diferentes fuentes sobre la misma.

El Síndrome Potro Lavanda (EPA) o también conocido como capa de color de dilución letal (CCDL), es un trastorno neurológico fatal que afecta a los potros recién nacidos. El trastorno se ha reconocido desde la década de 1950 y es una enfermedad rara pero significativa en el caballo árabe, principalmente en el subgrupo egipcio. En el texto: Whole-Genome SNP Association in the Horse: Identification of a Deletion in Myosin Va Responsible for Lavender Foal Syndrome, se define que aproximadamente el 10% de los árabes con líneas genéticas egipcias se cree que lleva a la mutación genética responsable del EPA.

El trastorno es causado por una mutación en Miosina-Va, una proteína motor que se encuentra en las células nerviosas, y causa problemas neurológicos graves inmediatamente después del nacimiento, aunque estos no son terminales para el potro se lleva a cabo la eutanasia del animal por los distintos efectos que producen. Aparte de los signos neurológicos, la característica más llamativa de esta condición es el pelaje o color de capa diluido. En unos pocos casos, el color es un muy llamativo plata pálida tonalidad lavanda, de ahí el nombre de “síndrome del potro lavanda”. El nombre más apropiado es dilución del color de escudo letal, ya que muchos potrillos afectados no muestran el sorprendente  color lavanda. Otros colores de la capa diluida observados en esta afección son de peltre (gris claro pizarra) y castaño claro (rosa). Ver Figuras 1 y 2 ilustrativas.

 

Potro lavanda

Figura 1: Potro afectado con Síndrome del potro lavanda. Fuente: Whole-Genome SNP Association in the Horse: Identification of a Deletion in Myosin Va Responsible for Lavender Foal Syndrome.

 

Potro lavanda y potro normalFigura 2: a la izquierda un potro normal y a la derecha uno con el Síndrome del potro lavanda. Fuente: Lavender Foal Syndrome- MYO5a.

Según explica BELLONE: “Los melanocitos se derivan de células embrionarias de origen en la cresta neural. Los melanocitos derivados de la cresta neural se encuentran en la piel, pelo, ciertas capas del ojo (melanocitos ovales), la oreja y leptomeninges interiores. En adición, las células madre embrionarias de origen en la cresta neural también dan lugar a hueso, cartílago, tejido adiposo, células endocrinas y varios tipos de neuronas y células gliales. Por lo tanto, no es sorprendente que las mutaciones en genes que funcionen en el desarrollo de melanocitos o la melanogénesis con frecuencia causan efectos pleiotrópicos que involucran la vista, el oído y la neurología del funcionamiento.” (BELLONE, 2010). Esto explica la relación entre el color de pelaje y piel con las afecciones neurológicas, ya que provienen del mismo origen embrionario en el desarrollo del potro. El aspecto neurológico de la condición surge de transporte aberrante de orgánulos en las neuronas, que a su vez perjudica la regulación sináptica. El color observado no es diluido debido a la producción de pigmento anormal, sino a una incorrecta dispersión de los melanosomas dentro de los ejes del pelo.

El síndrome es caracterizado por varios signos neurológicos que involucran tetania (contracciones musculares involuntarias), opistótonos (hiperextensión de la cabeza y el cuello), nistagmos (movimientos involuntarios de los ojos), y el movimiento de remar de los miembros. La temperatura, el pulso, la frecuencia respiratoria son normales al igual que las mucosas aparentes orales y la elasticidad de la piel. Los potros presentan un fuerte reflejo de succión y borborigmos audibles con estado de alerta, pero debido a la tetania no pueden incorporarse y mantenerse en pie.

Según lo que expresa FANELLI, en su artículo Coat colour dilution lethal (‘lavender foal syndrome’) a tetany syndrome of Arabian foals, es importante resaltar que la tetania no se ha observado en potros con EPA en el útero, por lo cual parece estar desencadenada luego del parto. Debido a la longitud de las extremidades del potro, el confinamiento del potro dentro del útero y a la naturaleza violenta de los episodios tetánicos, sería de esperar que la hembra tuviera una ruptura del útero.

Siguiendo con el artículo de FANELLI, es útil aclarar, los potros afectados pueden ser diagnosticados erróneamente que sufren de síndrome de inadaptación neonatal (SMN), septicemia neonatal o encefalopatía neonatal. Para ellos debe tenerse en cuenta que, potros septicémicos, no suelen ser afectados en el nacimiento y poseen convulsiones que puede verse con meningitis; muchos son afebriles, pero con hematología generalmente indican que son potros infectados. Los potros con EPA, que se mantienen con vida durante varios días, a menudo muestran lesiones de septicemia neonatal, aunque esta no la hayan adquirido antes de nacer. Los potros afectados con NE (encefalopatía neonatal) por lo general parecen normales al nacer, pero dentro de las primeras 24 horas muestran una pérdida completa y repentina del reflejo de succionar, disfunción cerebral, convulsiones con depresión respiratoria. Muchos potros afectados con NE pueden recuperarse pasando los 30 días desde el nacimiento. Los que mueren tienen lesiones en el SNC, pulmones y posiblemente otros órganos.

Herencia:

El Síndrome Potro lavanda es un trastorno autosómico recesivo. El término autosómico recesivo describe a uno de los patrones de herencia mendelianos y se caracteriza por no presentar el fenómeno de dominancia genética. En este patrón de herencia el fenotipo que caracteriza al alelo recesivo se encuentra codificado en un gen cuyo locus está  ubicado en alguno de los autosomas o cromosomas no determinantes del sexo, en este caso el cromosoma equino 1. Este alelo recesivo no se manifiesta si se encuentra acompañado por un alelo dominante.

Es decir, que por este mecanismo determinado síndrome heredable, se transmite en una forma que puede ser predecido sin tener en consideración el sexo del descendiente. Además para que esta característica heredable se exprese es necesario que el descendiente reciba el gen de ambos progenitores (Fig.: 3). Los adultos pueden llevar a una sola copia del gen mutado sin mostrar ningún síntoma, pero cuando dos caballos que son portadores son cruzados, un cuarto de la descendencia resultante se ven afectadas por el llamado síndrome del potro lavanda.

 

pedigree
Figura 3: Pedrigree de herencia autosómica recesiva. Fuente: Lavender Foal Syndrome- MYO5a.

Gen:

Los caballos son animales mamíferos provenientes de la familia de los équidos, tienen 32 pares de cromosomas ó 64 cromosomas 2n=64.

cariotipo equino

 

Figura 4: Cariotipo equino. Fuente: Genetics and Horses.

Como se explicó anteriormente el EPA es una condición autosómica recesiva y está causada por una deleción de una sola base de el gen en el cromosoma 1 MYO5A del caballo, que codifica la proteína de miosina Va. Esta proteína se mueve a lo largo de la actina vinculando los filamentos uno con otros, impulsados ​​por la hidrólisis de ATP. Miosina-Va se expresa en el cerebro y piel donde funciona en el transporte de orgánulos y tráfico de membrana, además juega un papel en la transporte axonal y dendrítico en neuronas. La miosina posee varias partes: la cadena pesada se compone de una cabeza globular N-terminal que es conservadas a través de las distintas clases de miosina, una región del cuello con una estructura alfa-helicoidal y un dominio de cola que consiste en un espiral helicoidal intercalados con dominios globulares y que termina en una cola globular C-terminal. La cabeza de la proteína contiene, los sitios para la hidrólisis de ATP y vinculante de actina y contiene aproximadamente 765 aminoácidos de longitud. La región del cuello contiene a la calmodulina con 147 aminoácidos. La estructura alfa-helicoidal es el sitio de dimerización, mientras que su segmento globular distal es responsable de la unión a carga y proteínas. La cola globular contiene al menos dos sitios de unión separada con una alta posibilidad para interactuar con una amplia gama de diferentes moléculas de carga.

En el texto: Lavender foal syndrome in Arabian horses is caused by a single-base deletion in the MYO5A gene, se describe la mutación de este síndrome dentro del cola de dominio globular de la proteína miosina Va.

Como expresa en su investigación BROOKS, “La deleción de una sola base en el exón 30 (ECA1 g.138235715del) se sospecha que provoca un cambio de marco que lleva a un codón de parada prematuro en una altamente conservada región del gen” (Brooks, 2010). Esto explica porque en la comparación de las secuencias de nucleótidos entre los equinos afectados y los individuos normales se revelaron solamente una variación de la secuencia en el fragmento amplificado. Por el desplazamiento del marco, que resulta en un codón de stop prematuro el ácido amino sustituido, arginina, y el truncamiento resultante de casi la mitad de la cola de proteína es la causante de mutación de la enfermedad.

Por lo tanto, esta parada de traducción prematura en la miosina produce que no sea capaz para el transporte intracelular. En el caso de melanocitos, a diferencia de aquellas mutaciones que los alteran en su migración y diferenciación, esta supresión alteraría la función de los melanocitos maduros, en los que el tráfico de melanosomas a la periferia de la célula por lo que la transferencia de  queratinocitos será interrumpida. Del mismo modo, en las células del sistema nervioso central, receptoras de glutamato y secretoras, los gránulos no serían transportados correctamente, y por lo tanto este podría explicar los diferentes defectos neurológicos del EPA.

Según BELLONE: “La mutación genética que causa este trastorno ha sido descubierto muy recientemente por un genoma completo a base de SNP enfoque de asociación. El rasgo mapeada a una región 10.5 -MB en ECA1 que contiene el candidato gen miosina VA (MYO5A) y la proteína ras-asociados RAB27A (RAB27A), que causan trastornos similares en ratones y los seres humanos (síndrome Griscelli). Además de neurológica anomalías, las mutaciones en RAB27A a menudo causan trastornos inmunológicos” (Bellone, 2010). Esto ubica a la mutación dentro del cromosoma 1 del equino donde se presenta el gen MYO5A.

 

 

 

 

 

 

 

 

cromosoma equino 1

 
Figura 5: Ubicación del gen MYO5A. Fuente: MYO5A Gene (protein coding).

BIERMAN, GUTHRIE Y HARPER aclaran, sobre la secuenciación directa de la región que contiene la delección, que los individuos afectados y portadores eran homocigotos y heterocigotos para la eliminación, respectivamente, mientras que la eliminación no se produjo en los individuos normales.

Además como exponen en su investigación BIERMAN, GUTHRIO Y HARPER: “Para identificar el defecto molecular que subyace a este trastorno, se produjo el secuenciado de la región codificante del gen en MYO5A, de los animales afectados y portadores normales. Se extrajo el ADN a partir de tejidos y muestras de sangre de cuatro potros afectados, sus padres y madres portadoras. Llevándose a cabo luego la amplificación por PCR de la

región de codificación MYO5A se realizó utilizando 12 conjuntos de cebadores”. La técnica de PCR junto con el conocimiento del genoma equino pudieron exponer cada parte del cariotipo con sus mutaciones más importantes, entre una de ellas el síndrome del potro lavanda o EPA, intentando evitar que se presenten nuevos casos de animales afectados por el alto porcentaje que presenta esta afección en la población total de caballos árabes.

La forma en la que se realiza el análisis por PCR se describe, según lo publicado por IGLESIAS, en el audio visual PCR o Reacción en cadena de la Polimerasa.
La PCR o reacción de la cadena de la polimerasa, es un método muy utilizado para amplificar y duplicar una determinada región de ADN, a partir de una muestra de tejido en este caso de pelo de la cola o crin del caballo a analizar. Esa región especifica que se quiere amplificar o secuenciar es llamada secuencia target, de la misma se pueden hacer millones de copias sin necesidad de purificar la muestra.

La técnica por PCR cuenta con la realización de distintos ciclos. El primer paso consta de elevar la temperatura a 95ºC para que se separen las cadenas o se desnaturalicen; luego se baja la temperatura a 60ºC para que se unan los primer específicos a cada una de las cadenas complementarias. Estos primer sirven como molde para que la polimerasa sintetice ADN hacia el extremo 3´usando nucleótidos libres a una temperatura de 72ºC. Solo esta región será amplificada por la polimerasa, debido a que solo puede hacerlo atraves de los primer específicos, en algunas cadenas no se detendrá hasta que la misma no se descarrile. Al final de este primer ciclo se ha formado dos cadenas doble hélice a partir de una.

En el segundo ciclo los tres pasos se repiten: desnaturalización a los 95ºC, unión de los primer específicos a 60ºC y síntesis de la polimerasa elevando la temperatura a 72ºC, de modo que se sintetiza de 3´a 5´obteniendose cuatro cadenas con un extremo 3´mas largo.

Al principio del ciclo tres vuelven a repetirse los pasos, al final podrán observarse dos moléculas doble cadena cortas especificas o target y seis moléculas doble cadena con extremo 3´mas largo. A medida que avanzan los ciclos la cantidad de moléculas crece exponencialmente, con lo cual, alrededor del ciclo treinta obtendremos mil millones de moléculas target o especificas y solo sesenta moléculas de cadena 3´mas larga que permanecen en la reacción, de esta manera es muy difícil que se produzca un error en la toma de target.

Debido a que rara vez el ADN de un individuo tiene las mismas secuencias de sitios de restricción y de distancia entre estos sitios, es que se procede a la técnica de fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP). Al cortar una muestra de ADN con enzimas de restricción concreta, se obtienen fragmentos de ADN de distinta longitud. Estos se separan por electroforesis que los ordena según la longitud de los mismos, utilizando una corriente eléctrica que los hace mover hacia el polo positivo sobre una hoja de gel.

 

La presencia o ausencia de delección se determina por el ensayo PCR-RFLP utilizando una endonucleasa que reconoce el sitio Fau I (CATATG). En el patrón de separación electroforética de un individuo normal (homocigoto dominante) comprende dos productos de PCR-RFLP, cada uno de longitud distinta; mientras que el análisis en un individuo que contiene la deleccion (homocigoto recesivo) posee una longitud equivalente a la suma de las longitudes de las dos obtenidas en un animal normal. En cambio un caballo portador (heterocigoto para ambos) tendrá tres productos, teniendo cada una uno longitud distinta. Ver figura 6 ilustrativa

PCR-RFLP

 

Figura 6: representación fotográfica de separación electroforética de muestras de varios individuos equinos, luego de haber sido sometido a la técnica de fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP). B: individuo homocigota recesivo portador del síndrome de potro lavanda. C: individuo heterocigota portador del síndrome. D y E: individuos homocigotas dominantes normales. Fuente: Identification of mutation and method for detecting lavender foal syndrome in the horse.

 

Conclusiones:

En esta monografía se expuso la información más importante del tema investigado. Debido a que el genoma equino fue descripto hace muy poco aún no se conocen todas las posibles mutaciones y sus relaciones, aunque una de las más importantes y sobre todo en los potros de raza árabe, es el síndrome del potro lavanda. Las afecciones que provocan no son totalmente letales pero dejan al animal imposibilitado para pararse y alimentarse por sí solo, debido a las afecciones neuronales, por lo cual el animal debe ser sacrificado. Como el gen MYO5A posee un alto porcentaje de herencia (10% en la población árabe y 25% en herencia mendeliana) es recomendable hacer análisis de pedigree en la busca de animales que no posean este gen recesivo oculto. Con técnicas de PCR se puede analizar no solo la secuenciación de los genes sino también el análisis funcional de los mismos en busca de mutaciones. En el caso de EPA la mutación del gen MOY5A, ubicado en el cromosoma 1 de los equinos, es una mutación maligna que causa la imposibilidad de mantener al potro con vida.

Bibliografía:

*ANIMAL GENETICS. “Lavender foal syndrome in Arabian horses is caused by a single-base deletion in the MYO5A gene”. A. Bierman, A. J. Guthrie and C. K. Harper. Laboratory and Department of Production Animal Studies, University of Pretoria, South Africa. 13 April 2010 (pág. 199-201).

 

*ANIMAL GENETICS. “Pleiotropic effects of pigmentation genes in horses”. R. R. Bellone. Department of Biology, University of Tampa USA. 21 June 2010. (pág: 100-110).

 

*BROOKS ET AL. “Identification of mutation and method for detecting lavender foal syndrome in the horse”. Samantha A. Brooks, Van Etten, NY (US); Nicole Gabreski, Coudersport, PA (US); Doug Antczak, Ithaca, NY (U S). Cornell University, Ithaca, NY (U S). Jan. 13, 2015.

 

 

*IGLESIAS, Gabriela. Audio visual: PCR o Reaccion en Cadena de la Polimerasa (audio latino). 9 de Marzo 2008. Pág. Web: https://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU

  • J. VET. INTERN. MED. “Clinical, Clinicopathologic, Postmortem Examination Findings and Familial History of 3 Arabians with Lavender Foal Syndrome”.Patrick Page, Rissa Parker, Cindy Harper, Alan Guthrie, and Johann Neser. Copyright 2006 by the American College of Veterinary Internal Medicine. (pág: 20:1491–1494).

 

*”Lavender Foal Syndrome- MYO5a”. Spring 2013. http://blackburngen677s13.weebly.com/domains.html

  • OPEN ACCESS. “Whole-Genome SNP Association in the Horse: Identification of a Deletion in Myosin Va Responsible for Lavender Foal Syndrome”. Samantha A. Brooks, Nicole Gabreski, Donald Miller, Abra Brisbin, Helen E. Brown, Cassandra Streeter, Jason Mezey, Deborah Cook, Douglas F. Antczak. Gregory S. Barsh, Stanford University School of Medicine, United States of America. Published April 15, 2010.

 

 

Otro video para reirse sobre PCR

Mauro un lector del Blog me ha dejado el link de este video de Biorad, una empresa que fabrica reactivos para PCR que es continuaci{on de algunos de los ya subidos en la página “PARA REIRSE” de este mismo Blog

Se les dejo y agradezco de nuevo a Mauro por compartirlo

 

Espero lo disfruten.

Saludos

¿Como empieza la historia de la Genética?

Esquema conceptual de la idea del blog (elaborado en CMAP tools TM)

Empecemos por el principio…Gregor Mendel en 1866 enuncia las tres leyes de la herencia, es decir explica como se transmiten las características de una generación a otra, aún sin saber que existían las gametas (ovocitos y espermatozoides). Por esto es más valiosa aún su visión. Así nace la Genética como ciencia. Es la ciencia que estudia la transmisión de las características, es decir las cualidades propias de cada individuo que son debidas a los genes (unidades de información en el ADN que luego se transforman en proteínas responsables de dichas características). Pueden ser el color de ojos, color de la piel, el tipo de proteínas que poseemos para distintas rutas metabólicas, el peso al nacimiento, etc.
Repasemos un poco la historia
La idea de este Blog es generar un espacio para acceder a los conocimientos de la biología molecular y su uso en la genética con sus diversas aplicaciones.

Durante la construcción de este Blog se podrá acceder a videos, fotos, comentarios, etc.y/o publicaciones de interés.

La Genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954 . Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combianciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.

Luego aparece el descubrimiento de las
enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su paracticidad y rapidez para amplificar una region de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis.

Aqui les dejo un video sobre la técnica.


http://www.youtube.com/get_player