Monografías de alumnos: DEFICIENCIA DE PIRUVATO QUINASA (PK) en caninos

AUTORES:

  • RIOS GIMENA
  • CRUZ MICAELA

Curso de Genética Básica. Carrera de Veterinaria. Universidad Nacional de Río Negro. Argentina. 2017

By Flickr user dmealiffe
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Deficiencia de piruvato quinasa (PK) en caninos

Introducción

La anemia hemolítica es un trastorno que genera la disminución de la masa de globulos rojos sanguíneos y puede ser causada por diferentes alteraciones, una de ellas es a nivel genético debido a una mutación del gen PKLR. Esta es una alteración autosómica recesiva que se caracteriza por una disminución en la actividad catalítica de la enzima piruvato quinasa. Este trastorno provoca que los glóbulos rojos se destruyan mas rápido de lo que la medula ósea pueda producirlos. El animal afectado puede presentar diferentes signos clínicos, como mucosas pálidas, aumento del ritmo cardiaco y una tolerancia reducida al ejercicio. Las razas más susceptibles a esta deficiencia son Labrador Retriever, Pug, Beagle y Basenji.

¿Qué es la piruvato quinasa?

La piruvato quinasa es una enzima importante en el metabolismo energético de los glóbulos rojos. Se trata de una enzima de la vía glucolítica y su actividad enzimática proporciona la mitad de la energía (moléculas de ATP) producida en dicha vía, en el interior del eritrocito. La falta de energía en forma de ATP hace que se altere el equilibrio dentro del hematíe y se pierda agua y potasio que hay en su interior, generando una deshidratación de la célula y su posterior lisis. Este trastorno hereditario causa una deficiencia en esta enzima que genera un marcado agotamiento de la vida útil de los glóbulos rojos y, por lo tanto, una anemia hemolítica grave, produciendo un bajo hematocrito debido a la lisis celular.(Harvey, JW 1995); (Henderson A, 2007)

Existen 4 variantes de la enzima PK las cuales son específicas de cada tejido, entre las mas importante a destacar se encuentran: M2: ubicada en músculo esquelético; la tipo R: presente en eritrocitos, y la tipo L: localizadas en el hepatocito. En un estudio realizado en perros de raza Basenjis, se ha demostrado que este trastorno genera una deficiencia en la actividad catalítica de la enzima piruvato quinasa tipo R, por lo tanto el organismo intenta compensarlo, aumentado las concentraciones de PK-M2 en eritrocitos. (Whitney KM, 1994)

¿Quién codifica a piruvato quinasa?

El gen responsable de codificar a la enzima piruvato quinasa se lo conoce como gen  PK-LR o también conocido como PK1; PKL; PKR; RPK, ubicado en el cromosoma 7 de los caninos.

La longitud de este gen es de 1972 pb, y presenta 12 exones.

La siguiente imagen corresponde al gen PKLR y su recuento de exones. Se pueden observar las diferentes variantes ya sea tipo R o L, en el cual el recuento de exones se reduce a 11. Esto se debe al proceso de maduración de ARN o también llamado splicing alternativo o empalme alternativo, en el cual se van todos los intrones y solamente quedan los exones, que permite obtener diferentes tipos de ARN mensajero y por ende diferentes isoformas de proteínas específicas de cada tejido.

PKLR figura 1
Fuente: NCBI

Figura 1. Esquema del gen PKLR en caninos

Figura 2 Genetica (2)
Figura 2. Variantes del gen PKLR en diferentes tejidos. Por Ríos, G. y Cruz, M

¿Cómo se hereda?

La deficiencia de la enzima piruvato quinasa es un rasgo autosómico recesivo que significa que ambos padres de un perro afectado son portadores del trastorno. Los portadores tienen aproximadamente la mitad de la actividad enzimática normal en los glóbulos rojos y no se ven afectados clínicamente. Si se aparean dos portadores pueden producir descendencia afectada. (Harvey, JW y col, 1995)

Dicho trastorno es un típico caso de dominancia incompleta o codominancia en la cual los homocigotas son fenotípicamente diferentes a los heterocigotas, no existe un rasgo dominante ni tampoco recesivo, pero la enfermedad se manifiesta en la descendencia.

Gametas           Hembra

Macho

 Aa
AAAAa
aAaaa

GENOTIPO                  FENOTIPO

AA  25%                      1/4  SANO

Aa  50%                       1/2PORTADOR

aa  25%                       1/4  ENFERMO

Figura 3. Cuadro de un entrecruzamiento de dos individuos heterocigotas, portadores. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Los perros con deficiencia de PK generalmente muestran signos de los 4 meses a 1 año de edad. Son lentos para crecer y muestran una leve debilidad y baja tolerancia al ejercicio. También muestran cambios en sus huesos, específicamente el reemplazo de la medula ósea por tejido fibroso y el endurecimiento o la densidad anormal del hueso (llamada mielofibrosis y osteoclerosis). Los perros con esta deficiencia por lo general mueren antes de los 4 años de edad debido a insuficiencia de la medula ósea y/o enfermedad hepática. (Harvey y col, 1995)

Mutaciones

Los resultados de los estudios realizados en diferentes razas de perros se pueden obtener de distintas regiones del gen, según se localice en cada raza. Cabe destacar que estos datos fueron obtenidos de un estudio realizado en el año 2012 con el objetivo de determinar la causa de la deficiencia de esta enzima en caninos. A continuación se describen las mutaciones puntuales para cada caso:

Labrador Retriever: el lugar donde ocurre la mutación se presenta en el exón 7, en el cual se genera un cambio en la base 799, de citocina por timina en el gen PKLR (mutación o sustitución de sentido erróneo), dando como resultado un codón de stop prematuro (TAA) debido a la terminación temprana de la enzima, la cual carece de sitios activos importantes en la unión al sustrato. (G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Labrador Retriever, cambio de Citocina por Timina en la base 799. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 4. Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Labrador Retriever, cambio de Citocina por Timina en la base 799. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Pug: se encontró una sustitución en el exón 7, en la base 848 que origino un cambio de timina por citocina, esta mutación puntual cambia a GTC que codifica valina, en GCT que codifica alanina, generando una proteína diferente con una mínima actividad catalítica.(G. InalGultekin y col. 2012)

squema de la mutación del gen PKLR en un canino de raza Pug, sustitución de Timina por Citocina en la base 848, generando una proteína diferente. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 5. Esquema de la mutación del gen PKLR en un canino de raza Pug, sustitución de Timina por Citocina en la base 848, generando una proteína diferente. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Beagle: se descubrió una mutación de sustitución de una sola base en el exón 8 del gen PK-LR. (sustitución de sentido erróneo) Esta mutación puntual cambia el codón GGC a AGC y así reemplaza a una glicina por una serina. Sólo la glicina es tolerada en esta posición por lo tanto es muy probable que esta mutación cause una proteína no funcional. (G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Beagle, sustitución de Guanina por Alanina generando una proteína diferente no funcional. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 6. Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Beagle, sustitución de Guanina por Alanina generando una proteína diferente no funcional. Por Ríos, G. y Cruz, M.

METODOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR

Las mutaciones fueron detectadas por PCR-RFLP en perros de raza Labrador, Pug y Beagle.

El segmento a amplificar fue de 188 pares de bases del exón 7. Los productos fueron digeridos con enzimas de restricción que cortan, en el  labrador al alelo silvestre 2 veces produciendo 3 fragmentos, de 96, 46, 46. El alelo afectado, en cambio,es cortado solamente 1 vez, produciendo un fragmento de 142 y 46 pb ya que la enzima no reconoce un sitio de corte al cambiar una base por otra. (G. InalGultekin y col. 2012)

En el caso del pug los productos de la digestión, son cortados en 2 bandas de 141 y 47 pb para el alelo normal, mientras que al alelo mutante le falta el sitio de restricción y no corta, mostrando así los 188 pb.

Por último, en el caso de los Beagle, la digestión corta al alelo silvestre de 109 pb en un fragmento de 90 y otro de 19 pb, mientras que el alelo mutante no se digiere, mostrando la banda no cortada a 109 pb. El segmento que se amplifico en esta raza se obtuvo del exón 8.(G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema del producto de amplificación para raza en particular. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 7. Esquema del producto de amplificación para raza en particular. Por Ríos, G. y Cruz, M.

IMPORTANICIA DE SU DIAGNOSTICO

Debido a que es un rasgo autonómico recesivo, ambos padres de los perros afectados portan el gen defectuoso. Los individuos heterocigotos generalmente son asintomáticos y puede ser difícil detectar signos clínicos en ellos, por eso, es útil comprobar la presencia de la enfermedad antes de la reproducción. Este es uno de los factores más importante a tener en cuenta en los lugares dedicados a la cría, ni los perros afectados (homocigota recesivo) ni los portadores (heterocigota) deben utilizarse en la reproducción, debe ser un conocimiento fundamental para los criadores que buscan detectar portadores y eliminarlos de la población reproductiva. (Gultekin GI, y col. 2012)

Actualmente se han registrado 10 casos de deficiencia de PK en todo Estados unidos, 40 en Europa y 11 en Sudamérica. Pero se sospecha que la incidencia es mayor debido a que la mayoría de los perros utilizados para detectar la deficiencia de PK proviene de casas de cría. (G. Inal Gultekin y col, 2012)

Conclusión:

Debe considerarse la deficiencia de la enzima piruvato quinasa en caninos como una importante alteración que produce una anemia hemolítica grave y pone en riesgo la calidad y tiempo de vida del animal, limitándose a ciertas razas de perros particularmente. Es una alteración autosómica recesiva, siendo ambos padres del afectado, portadores de la mutación, por eso es importante conocer esta patología y detectar animales afectados o portadores de ésta, para no seguir aumentando el porcentaje de caninos con dicha deficiencia.

Bibliografía:

Harvey, JW 1995. Anemias hemolíticas congénitas y metahemoglobinemias. ACVIM-Proceedings del 13. ° Foro Médico Veterinario Anual: 37-40.
Henderson A. Anemia, Hemolítico. En: Côté E, ed. Asesor Clínico Veterinario Perros y Gatos. Missouri: Mosby Elsevier, 2007: 64-66.
Sargan DR. Deficiencia de piruvato quinasa. Disponible en 
vetGen : información sobre pruebas genéticas disponibles (basenjis y terriers blancos de las Highlands occidentales)

Inal Gultekin, G., Raj, K., Foureman, P., Lehman, S., Manhart, K., Abdulmalik, O., & Giger, U. (2012).Erythrocytic pyruvate kinase mutations causing hemolytic anemia, osteosclerosis, and secondary hemochromatosis in dogs. Journal of veterinaryinternal medicine, 26(4), 935-944.

Whitney, K. M., Goodman, S. A., Bailey, E. M., & Lothrop Jr, C. D. (1994). The molecular basis of canine pyruvate kinase deficiency. Experimental hematology, 22(9), 866-874.

WHITNEY, K. M., et al. The molecular basis of canine pyruvate kinase deficiency. Experimental hematology, 1994, vol. 22, no 9, p. 866-874.

Mas información: aqui

y aquí:

Neutropenia cíclica en Collies. Monografías de alumnos

collie gris

Nuevamente les dejo una monografìa de mi alumno Nicolás Cugliari  de 3er año de la carrera de Veterinaria de la Univ. Nacional de Río Negro, sobre una enfermedad hereditaria en caninos denominada NEUTROPENIA CICLICA EN CANINOS (Collies). Espero que les sirva a muchos otros en el camino del aprendizaje.

Neutropenia cíclica

Universidad Nacional de Río Negro
Genética Básica
2015 Cugliari Nicolás

Introducción

Neutropenia cíclica, también conocida como síndrome del Collie gris es una alteración autosómica recesiva, producida por la mutación del gen AP3B1 que afecta a la raza Collie. Se caracteriza por la disminución crítica en la cantidad de neutrófilos de manera cíclica. Esto deja vulnerable al animal al ataque de agentes bacterianos. Los animales afectados muestran una serie de signos y una dilución del color del pelaje que junto a técnicas de laboratorio permiten diagnosticar el desorden genético.

Enfermedad

La mutación provoca que las “stem cells” o células madre de la médula ósea funcionen de manera anormal. Este tejido se encarga de la formación y maduración de las células sanguíneas. Consecuentemente, esta afección genera trastornos en la producción de leucocitos. Entre estos, los más afectados son los neutrófilos, principales encargados de la fagocitosis y primeros defensores ante una infección. El recuento de neutrófilos en banda y segmentados puede dar 0 o un valor cercano. La actividad de los pocos neutrófilos circulantes se muestra desequilibrada e incapaz de cumplir sus funciones inmunológicas ante, principalmente, bacterias. Se ha observado que en ocasiones puede darse una disminución considerable de plaquetas, lo cual lleva a hemorragias. El número de otros glóbulos blancos puede disminuir sin tener grandes repercusiones. (Patt, et al. 1973.)
El proceso en perros infectados dura aproximadamente 20 días y se produce de manera repetitiva cada 2 a 10 días. El número de leucocitos se normaliza al cabo de una semana aproximadamente gracias a una serie de mecanismos de retoralimentación que tienen lugar en la médula ósea. (Dale, et al 1972)
La disminución de neutrófilos generada por este trastorno facilita el ingreso y la supervivencia de agentes bacterianos una vez dentro del perro. Por lo tanto, animales afectados son susceptibles a todo tipo de infecciones sobre todo bacterianas en piel, ojo y sistema respiratorio. (Lund, et al 1967)
Externamente la neutropenia cíclica genera una dilución en el color del Collie, alcanzando un color grisáceo y ocasionalmente beige.
Entre 8 y 12 semanas luego de nacer, los cachorros enfermos comienzan a manifestar los síntomas. Son de menor tamaño, más débiles y si no se los trata no llegan a superar el año de vida. Aún recibiendo el cuidado apropiado, es decir, siendo monitoreado y suministrado antibióticos, la expectativa de vida no supera los 4 años de vida. (Pacheco, et al 2008)

Herencia

La enfermedad solo afecta a perros que reciben dos copias del gen mutado, es decir, se hereda como recesivo. La misma puede manifestarse en algún punto de su vida. Los perros enfermos transmiten una sola copia de la mutación a sus descendientes.
A aquellos animales que tienen un solo gen mutado se los denomina portadores. No desarrollan la enfermedad pero tienen un 50% de probabilidad de transmitir una copia mutada del gen a sus descendientes.
Los perros que tienen dos genes normales son considerados libres, por lo tanto, no pueden trasmitir genes mutados ni desarrollar la enfermedad. A diferencia de los enfermos y portadores no manifiestan color gris plateado en el pelaje.
Gen AP3B1

El gen AP3B1 o adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit se encuentra en el cromosoma 3 del perro. Está formado por 25 intrones, 27 exones y una secuencia de nueve bases. Fue mapeado por medio de análisis de ligamiento de alta densidad. (Benson, et al 2004.)
Este codifica una subunidad del complejo proteico adaptador AP3, involucrado en el transporte de proteinas entre lisosomas y el complejo de Golgi, más específicamente, de la ELA 2 o neutrófilo elastasa. La subunidad del AP3 se asocia a la neutrófilo elastasa o ELA2 a través de una señal basada en la tirosina cerca a su extremo C-terminal y actuando como su transportador. (Meng, 2010.)

Mutación

La mutación consiste en la inserción de un residuo extra de adenina en una cadena de adeninas ubicadas en el exon 21 del gen AP3B1.
Perros heterocigota portadores, que tienen un alelo normal y uno mutado, producen una población homogénea de transcripciones normales del gen. En este caso contienen nueve adeninas en el alelo normal y diez en el mutado.
En el caso de perros homocigota afectados, que tienen dos alelos mutados, producen una población heterogénea de ARNm del AP3B1 conteniendo transcripciones mutadas con diez adeninas.
Las mutaciones en la subunidad beta del complejo A3 provocan inestabilidad del gen, haciendo que los neutrófilos de perros afectados tengan deficiencia en la elastasa. La deficiencia de ELA2 permite que se acumulen proteinas precursoras de la elastasa en sus gránulos primarios. (Meng, 2010)

Diagnóstico

El diagnóstico de la neutropenia cíclica se realiza mediante un hemograma que determine la disminución o en ocasiones ausencia de neutrófilos. Para ello se relacionan los signos manifestados y el color del pelaje.
El pelo sufre una dilución en el color tornándose gris plateado y puede que beige. Los animales enfermos presentan fiebre, diarrea, dolor en las articulaciones e infecciones cutáneas, oculares y respiratorias.
Para la detección de la mutación primero se obtuvo una secuencia parcial del cADN del gen AP3B1 para realizar un análisis northern-blot del ARN total extraído de la sangre del perro. La técnica llamada Northern-blot o ensayo Northern es similar al Southern-blot pero, este es utilizado en la detección de moléculas de ARN de una secuencia. Se toma una mezcla de ARN y se la somete a una electroforesis en gel. Se separan los fragmentos de acuerdo al tamaño y se los transfiere a una membrana cargada positivamente donde se produce la hibridación de una sonda molecular marcada radiactivamente. (Watson, 2004.)
La transcripción aparece ausente en el perro afectado y la mitad aproximadamente de la misma en portadores, comparándolos con animales de otras razas a modo de control.
A continuación se clonó completamente el cADN de AP3B1 aislando totalmente el ARN de la sangre del animal y realizando una carrera de 5’-3’. (Benson, KF., et al.)

Benson et. al, 2004
Benson et. al, 2004

Los perros afectados mostraron dos secuencias de transcripción que diferían por la presencia de un residuo de adenina extra en la secuencia de nueve adeninas. Posteriormente se determinó la secuencia genómica del AP3B1 por un recorrido en los intrones a partir de los exones identificados en el cADN. Esto permite establecer primers para la amplificación de la secuencia de adeninas en el gen AP3B1 a partir de ADN genómico. La misma se realiza utilizando la técnica de PCR o reacción en cadena de polimerasa. Esta consiste en la síntesis de ADN por medio de la ADN polimerasa de manera automatizada a partir de cebadores. El proceso se da por complementariedad de bases. (Benson, KF., et al.)
Los resultados determinaron que Collies afectados son homocigota y los portadores heterocigota debido a la inserción de una adenina adicional en la secuencia de nueve adeninas. Dicha secuencia se ubica en el exon 21 del gen AP3B1.
La aparente auscencia de la transcripción del alelo mutado en heterocigotas es el resultado de una degradación selectiva de transcripciones mutadas.

Neutropenia
Benson et al 2004

Tratamiento

La neutropenia cíclica puede ser curada por medio de transplante medular. Estos sin embargo, resultan poco práctico, limitándose el tratamiento solo a monitoreos y administración de antibióticos. Sin embargo, a pesar de los cuidados, los perros enfermos no superan los cuatro años de vida.

Referencias

  • Benson, KF., Person, RE., Li, FQ., Williams, K., Horwitz, M. 1. 2004.
    Paradoxical homozygous expression from heterozygotes and heterozygous expression from homozygotes as a consequence of transcriptional infidelity through a polyadenine tract in the AP3B1 gene responsible for canine cyclic neutropenia. Nucleic Acids Res 32:6327-33, 2004. Pubmed reference: 15576359. DOI: 10.1093/nar/gkh974.
  • Benson, K.F., Li, F.Q., Person, R.E., Albani, D., Duan, Z., Wechsler, J., Meade-White, K., Williams, K., Acland, G.M., Niemeyer, G., Lothrop, C.D., Horwitz, M. 2. 2003
    Mutations associated with neutropenia in dogs and humans disrupt intracellular transport of neutrophil elastase Nature Genetics 35:90-6, 2003. Pubmed reference: 12897784.
  • Dale, D.C., Alling, D.W., Wolff, S.M. 1972
    Cyclic hematopoiesis: the mechanism of cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Journal of Clinical Investigation 51:2197-2204, 1972. Pubmed reference: 5054472. DOI: 10.1172/JCI107027.
  • Lund, J.E., Padgett, G.A., Ott, R.L. 1967.
    Cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Blood 29:452-461, 1967. Pubmed reference: 6067150.
  • Pacheco, J.M., Traulsen, A., Antal, T., Dingli, D. 2008.
    Cyclic neutropenia in mammals. Am J Hematol 83:920-1, 2008. Pubmed reference: 18951469. DOI: 10.1002/ajh.21295.
  • Patt, H.M., Lund, J.E., Maloney, M.A. 1973
    Cyclic hematopoiesis in grey Collie dogs: a stem cell problem Blood 42:873-884, 1973. Pubmed reference: 4796766.
  • Meng, R., Bridgman, R., Toivio-Kinnucan, M., Niemeyer, GP., Vernau, W., Hock, T., Lothrop, CD. :
    Neutrophil elastase-processing defect in cyclic hematopoietic dogs. Exp Hematol 38:104-15, 2010. Pubmed reference: 19941936. DOI: 10.1016/j.exphem.2009.09.010.
  • Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edición). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.