Monografías de alumnos: DEFICIENCIA DE PIRUVATO QUINASA (PK) en caninos

AUTORES:

  • RIOS GIMENA
  • CRUZ MICAELA

Curso de Genética Básica. Carrera de Veterinaria. Universidad Nacional de Río Negro. Argentina. 2017

By Flickr user dmealiffe
By Flickr user dmealiffe

Deficiencia de piruvato quinasa (PK) en caninos

Introducción

La anemia hemolítica es un trastorno que genera la disminución de la masa de globulos rojos sanguíneos y puede ser causada por diferentes alteraciones, una de ellas es a nivel genético debido a una mutación del gen PKLR. Esta es una alteración autosómica recesiva que se caracteriza por una disminución en la actividad catalítica de la enzima piruvato quinasa. Este trastorno provoca que los glóbulos rojos se destruyan mas rápido de lo que la medula ósea pueda producirlos. El animal afectado puede presentar diferentes signos clínicos, como mucosas pálidas, aumento del ritmo cardiaco y una tolerancia reducida al ejercicio. Las razas más susceptibles a esta deficiencia son Labrador Retriever, Pug, Beagle y Basenji.

¿Qué es la piruvato quinasa?

La piruvato quinasa es una enzima importante en el metabolismo energético de los glóbulos rojos. Se trata de una enzima de la vía glucolítica y su actividad enzimática proporciona la mitad de la energía (moléculas de ATP) producida en dicha vía, en el interior del eritrocito. La falta de energía en forma de ATP hace que se altere el equilibrio dentro del hematíe y se pierda agua y potasio que hay en su interior, generando una deshidratación de la célula y su posterior lisis. Este trastorno hereditario causa una deficiencia en esta enzima que genera un marcado agotamiento de la vida útil de los glóbulos rojos y, por lo tanto, una anemia hemolítica grave, produciendo un bajo hematocrito debido a la lisis celular.(Harvey, JW 1995); (Henderson A, 2007)

Existen 4 variantes de la enzima PK las cuales son específicas de cada tejido, entre las mas importante a destacar se encuentran: M2: ubicada en músculo esquelético; la tipo R: presente en eritrocitos, y la tipo L: localizadas en el hepatocito. En un estudio realizado en perros de raza Basenjis, se ha demostrado que este trastorno genera una deficiencia en la actividad catalítica de la enzima piruvato quinasa tipo R, por lo tanto el organismo intenta compensarlo, aumentado las concentraciones de PK-M2 en eritrocitos. (Whitney KM, 1994)

¿Quién codifica a piruvato quinasa?

El gen responsable de codificar a la enzima piruvato quinasa se lo conoce como gen  PK-LR o también conocido como PK1; PKL; PKR; RPK, ubicado en el cromosoma 7 de los caninos.

La longitud de este gen es de 1972 pb, y presenta 12 exones.

La siguiente imagen corresponde al gen PKLR y su recuento de exones. Se pueden observar las diferentes variantes ya sea tipo R o L, en el cual el recuento de exones se reduce a 11. Esto se debe al proceso de maduración de ARN o también llamado splicing alternativo o empalme alternativo, en el cual se van todos los intrones y solamente quedan los exones, que permite obtener diferentes tipos de ARN mensajero y por ende diferentes isoformas de proteínas específicas de cada tejido.

PKLR figura 1
Fuente: NCBI

Figura 1. Esquema del gen PKLR en caninos

Figura 2 Genetica (2)
Figura 2. Variantes del gen PKLR en diferentes tejidos. Por Ríos, G. y Cruz, M

¿Cómo se hereda?

La deficiencia de la enzima piruvato quinasa es un rasgo autosómico recesivo que significa que ambos padres de un perro afectado son portadores del trastorno. Los portadores tienen aproximadamente la mitad de la actividad enzimática normal en los glóbulos rojos y no se ven afectados clínicamente. Si se aparean dos portadores pueden producir descendencia afectada. (Harvey, JW y col, 1995)

Dicho trastorno es un típico caso de dominancia incompleta o codominancia en la cual los homocigotas son fenotípicamente diferentes a los heterocigotas, no existe un rasgo dominante ni tampoco recesivo, pero la enfermedad se manifiesta en la descendencia.

Gametas           Hembra

Macho

 Aa
AAAAa
aAaaa

GENOTIPO                  FENOTIPO

AA  25%                      1/4  SANO

Aa  50%                       1/2PORTADOR

aa  25%                       1/4  ENFERMO

Figura 3. Cuadro de un entrecruzamiento de dos individuos heterocigotas, portadores. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Los perros con deficiencia de PK generalmente muestran signos de los 4 meses a 1 año de edad. Son lentos para crecer y muestran una leve debilidad y baja tolerancia al ejercicio. También muestran cambios en sus huesos, específicamente el reemplazo de la medula ósea por tejido fibroso y el endurecimiento o la densidad anormal del hueso (llamada mielofibrosis y osteoclerosis). Los perros con esta deficiencia por lo general mueren antes de los 4 años de edad debido a insuficiencia de la medula ósea y/o enfermedad hepática. (Harvey y col, 1995)

Mutaciones

Los resultados de los estudios realizados en diferentes razas de perros se pueden obtener de distintas regiones del gen, según se localice en cada raza. Cabe destacar que estos datos fueron obtenidos de un estudio realizado en el año 2012 con el objetivo de determinar la causa de la deficiencia de esta enzima en caninos. A continuación se describen las mutaciones puntuales para cada caso:

Labrador Retriever: el lugar donde ocurre la mutación se presenta en el exón 7, en el cual se genera un cambio en la base 799, de citocina por timina en el gen PKLR (mutación o sustitución de sentido erróneo), dando como resultado un codón de stop prematuro (TAA) debido a la terminación temprana de la enzima, la cual carece de sitios activos importantes en la unión al sustrato. (G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Labrador Retriever, cambio de Citocina por Timina en la base 799. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 4. Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Labrador Retriever, cambio de Citocina por Timina en la base 799. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Pug: se encontró una sustitución en el exón 7, en la base 848 que origino un cambio de timina por citocina, esta mutación puntual cambia a GTC que codifica valina, en GCT que codifica alanina, generando una proteína diferente con una mínima actividad catalítica.(G. InalGultekin y col. 2012)

squema de la mutación del gen PKLR en un canino de raza Pug, sustitución de Timina por Citocina en la base 848, generando una proteína diferente. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 5. Esquema de la mutación del gen PKLR en un canino de raza Pug, sustitución de Timina por Citocina en la base 848, generando una proteína diferente. Por Ríos, G. y Cruz, M.

Beagle: se descubrió una mutación de sustitución de una sola base en el exón 8 del gen PK-LR. (sustitución de sentido erróneo) Esta mutación puntual cambia el codón GGC a AGC y así reemplaza a una glicina por una serina. Sólo la glicina es tolerada en esta posición por lo tanto es muy probable que esta mutación cause una proteína no funcional. (G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Beagle, sustitución de Guanina por Alanina generando una proteína diferente no funcional. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 6. Esquema de la mutación del gen PKLR en canino de raza Beagle, sustitución de Guanina por Alanina generando una proteína diferente no funcional. Por Ríos, G. y Cruz, M.

METODOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR

Las mutaciones fueron detectadas por PCR-RFLP en perros de raza Labrador, Pug y Beagle.

El segmento a amplificar fue de 188 pares de bases del exón 7. Los productos fueron digeridos con enzimas de restricción que cortan, en el  labrador al alelo silvestre 2 veces produciendo 3 fragmentos, de 96, 46, 46. El alelo afectado, en cambio,es cortado solamente 1 vez, produciendo un fragmento de 142 y 46 pb ya que la enzima no reconoce un sitio de corte al cambiar una base por otra. (G. InalGultekin y col. 2012)

En el caso del pug los productos de la digestión, son cortados en 2 bandas de 141 y 47 pb para el alelo normal, mientras que al alelo mutante le falta el sitio de restricción y no corta, mostrando así los 188 pb.

Por último, en el caso de los Beagle, la digestión corta al alelo silvestre de 109 pb en un fragmento de 90 y otro de 19 pb, mientras que el alelo mutante no se digiere, mostrando la banda no cortada a 109 pb. El segmento que se amplifico en esta raza se obtuvo del exón 8.(G. InalGultekin y col. 2012)

Esquema del producto de amplificación para raza en particular. Por Ríos, G. y Cruz, M.
Figura 7. Esquema del producto de amplificación para raza en particular. Por Ríos, G. y Cruz, M.

IMPORTANICIA DE SU DIAGNOSTICO

Debido a que es un rasgo autonómico recesivo, ambos padres de los perros afectados portan el gen defectuoso. Los individuos heterocigotos generalmente son asintomáticos y puede ser difícil detectar signos clínicos en ellos, por eso, es útil comprobar la presencia de la enfermedad antes de la reproducción. Este es uno de los factores más importante a tener en cuenta en los lugares dedicados a la cría, ni los perros afectados (homocigota recesivo) ni los portadores (heterocigota) deben utilizarse en la reproducción, debe ser un conocimiento fundamental para los criadores que buscan detectar portadores y eliminarlos de la población reproductiva. (Gultekin GI, y col. 2012)

Actualmente se han registrado 10 casos de deficiencia de PK en todo Estados unidos, 40 en Europa y 11 en Sudamérica. Pero se sospecha que la incidencia es mayor debido a que la mayoría de los perros utilizados para detectar la deficiencia de PK proviene de casas de cría. (G. Inal Gultekin y col, 2012)

Conclusión:

Debe considerarse la deficiencia de la enzima piruvato quinasa en caninos como una importante alteración que produce una anemia hemolítica grave y pone en riesgo la calidad y tiempo de vida del animal, limitándose a ciertas razas de perros particularmente. Es una alteración autosómica recesiva, siendo ambos padres del afectado, portadores de la mutación, por eso es importante conocer esta patología y detectar animales afectados o portadores de ésta, para no seguir aumentando el porcentaje de caninos con dicha deficiencia.

Bibliografía:

Harvey, JW 1995. Anemias hemolíticas congénitas y metahemoglobinemias. ACVIM-Proceedings del 13. ° Foro Médico Veterinario Anual: 37-40.
Henderson A. Anemia, Hemolítico. En: Côté E, ed. Asesor Clínico Veterinario Perros y Gatos. Missouri: MosbyElsevier, 2007: 64-66.
Sargan DR. Deficiencia de piruvato quinasa. Disponible en 
vetGen : información sobre pruebas genéticas disponibles (basenjis y terriers blancos de las Highlands occidentales)

Inal Gultekin, G., Raj, K., Foureman, P., Lehman, S., Manhart, K., Abdulmalik, O., & Giger, U. (2012).Erythrocytic pyruvate kinase mutations causing hemolytic anemia, osteosclerosis, and secondary hemochromatosis in dogs. Journal of veterinaryinternal medicine, 26(4), 935-944.

Whitney, K. M., Goodman, S. A., Bailey, E. M., & Lothrop Jr, C. D. (1994). The molecular basis of canine pyruvate kinase deficiency. Experimental hematology, 22(9), 866-874.

WHITNEY, K. M., et al. The molecular basis of canine pyruvate kinase deficiency. Experimental hematology, 1994, vol. 22, no 9, p. 866-874.

Mas información: aqui

y aquí:

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Paladar hendido y labio leporino en Caninos. Monografìas de alumnos

http://www.seamosmasanimales.com/2014/10/el-triunfo-de-ruby-la-pit-bull-que-quisieron-sacrificar-por-tener-el-paladar-hendido.html
El triunfo de Rudy. Fuente:

Nuevamente les dejo la monografía de una de mis alumnas de este año sobre una patología hereditaria en caninos:

Paladar hendido y labio leporino en Caninos

Monografía de Genética

Universidad Nacional de Rio Negro

Profesora: Iglesias,Gabriela

Alumna: Aciar, María Belén

Introducción:

El paladar hendido se caracteriza porque existe una comunicación anormal entre las cavidades oral y nasal que afecta a paladar blando, duro, hueso pre maxilar y labio. Se clasifica en paladar hendido primario y secundario y ambos están en íntima relación pues tienen el mismo origen embrionario. 

Desarrollo:

El paladar se divide en paladar duro y paladar blando. El primero es la estructura formada por huesos incisivo, maxilar y por mucosa nasal y bucal que separa la cavidad nasal de la bucal. Mientras que el paladar blando es la continuación caudal que divide la nasofaringe de la oro faringe y no presenta estructuras óseas .En pequeños animales las alteraciones más frecuentes del paladar son: paladar hendido (que puede afectar tanto el paladar duro como blando) y paladar elongado (que solo afecta al paladar blando)

El paladar hendido es una comunicación anormal entre las cavidades bucal y nasal que implican el paladar blando, paladar duro, pre maxilar y labio . El paladar primario lo constituyen el labio y el pre maxilar, si cierre incompleto es lo que se llama hendidura primaria o labio partido (Labio leporino).

Mientras que el paladar secundario lo constituye el paladar duro, paladar blando; y el cierre incompleto de cualquiera de estas dos se denomina hendidura secundaria o paladar hendido.[1]

http://www.uco.es/organiza/departamentos/anatomia-y-anat-patologica/peques/curso08_09/paladar1.pdf
Fuente: Aquí 

Los defectos se producen cuando las dos capas palatinas no logran fusionarse totalmente durante el desarrollo fetal ocurriendo aproximadamente entre los 25 o 28 días de la gestación en los perros. El riesgo grave de esta malformación reside en la dificultad que tienen las crías para su alimentación, ya que les es imposible succionar siéndole imposible realizar dicha acción ,generando que muchos animales mueran a los pocos días de nacer o bien son sacrificados. Las complicaciones de esta alteración son, fundamentalmente, problemas de naturaleza respiratoria como rinitis irritativas crónicas, faringitis, laringitis, otitis medias con síndrome vestibular periférico y neumonías por aspiración, que pueden llegar a ser mortales.

Estos defectos se han observado sobre todo en razas braquicéfalos con una incidencia mayor en razas puras que mestizas, entre estas razas las de mayor riesgo son: Terrier de Boston, Pekines, Bulldog, Schnauzer miniatura, Beagle, Cockerspaniel.[2]

Fuente: aqui

Razas susceptibles: 

En los seres humanos y los perros, el labio leporino y paladar hendido ocurren naturalmente con diferentes grados de gravedad, y puede ser causada por varios factores genéticos y ambientales (carencias de minerales, de vitamina A, exposición de la madre a rayos X, tóxicas, corticoides, influencias hormonales y causas mecánicas). Con el fin de comprender mejor el paladar hendido en ser humanos se ha llevado a cabo varios estudios y trabajo de investigación con el mejor amigo del hombre “el perro” siendo un modelo único para ayudar a comprender las bases genéticas de origen natural.[4]

Razas susceptibles. https://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAYQjB1qFQoTCImP1evsnMkCFQKrkAodsPIM5A&url=https%3A%2F%2Fia.wikipedia.org%2Fwiki%2FBulldog&psig=AFQjCNFnSO0Um0Y2BEqaxf1cKp1KTjqvgA&ust=1448034989217548
Fuente: aqui

Con el fin de estudiar el paladar hendido en un sistema de modelo natural se utilizó el Retriver de Nueva Escocia (NSDTR)

http://www.venfido.com.mx/raza.php?nombre=cobrador-de-nueva-escocia
Fuente aqui:

DLX es una familia homeodominio. Estos genes DLX en vertebrados se expresan principalmente a nivel craneofacial, involucrado en el desarrollo del cerebro y extremidades del cuerpo, incluyendo Cresta Ectodérmica Apical. Los miembros conocidos de la familia incluyen desde DLX1 hasta DLX6.

DLX5 y DLX6 se seleccionaron para la secuenciación, estos genes codifican un miembro de un homeobox (secuencia de AN que se encuentran involucrados en la regulación de los patrones de desarrollo anatómico) siendo una familia de genes de factor de transcripción.

DLX5 y DLX6 se pueden ver para trabajar en conjunto y son esencialmente necesarias para el correcto desarrollo craneofacial, axial, y el esqueleto apendicular, cuando se produce la inactivación selectiva de dichos genes pueden conducir a tener una gran probabilidad de letalidad perinatal.[6]

En el siguiente gráfico veremos lo dicho anteriormente: (IMAGEN 7)

Esta imagen demuestra un Pedigree de 7 familias de NSDTR que representan la segregación del alelo mutante con la LINE-1 elemento de inserción. Los símbolos llenos representan NSDTRs con el fenotipo CP1. Las líneas diagonales indican que el NSDTR ha fallecido. “+” Representa el alelo de tipo salvaje. “M” representa el alelo mutante.[7]

El análisis de segregación y alelo de frecuencia, se llevó a cabo en el gen DLX6 Line-1 indicando que dicha inserción segrega tanto con el fenotipo y con modo de herencia autosómico recesivo. En dicha imagen también podemos observar que en cada familia del pedigree hay cierta probabilidad de letalidad.[7]

 

También se realizó un PCR de amplificación y análisis de la inserción LINEA en el CP1 y NSDTR. 

 journal.pgen.1004257.g003.png

Fuente aqui

Se realizó en DNA a partir de la corteza cerebral, tanto para DLX5 y DLX6. DLX5 y DLX6 fueron secuenciados en un neonatal NSDTRCP1 con la inserción LINE- 1 y se compararon con un solo neonatal NSDTR de control no afectado. No se identificaron polimorfismos dentro de DLX5 .El ADNc a partir del CP1 NSDTR mostró tanto la transcripción DLX6 de tipo salvaje y una transcripción más grande que contenía 1281 pares de bases de la intrónica LINE- 1 de inserción.[7]

El análisis de secuencia y la traducción de los aproximadamente 1,2 kilobases LINE- 1 de inserción predicen un codón de stop después de la inserción de un nuevo exón.[7] 

journal.pgen.1004257.g004
Fuente: aquí

Esquema de la estructura del gen genómico y DNA del DLX6 no afectado y (CP1) NSDTR afectado. La región de la conservación representada en rojo es la región interrumpido por la inserción LINE- 1. [7]

Materiales y métodos:

Muestras caninas y extracción de ADN

Se extrajeron muestras de sangre y tejidos de NSDTRs con paladar hendido (n = 14), hermanos de camada sanos ( n = 24) , padres (n = 11), NSDTRs no afectadas (n = 153 ). El tejido se recogió en el examen post mortem y flash congelado . Las evaluaciones de las hendiduras orofaciales se realizaron por inspección visual de los perros afectados.[8]

Imagen Computarizada

Tomografía computarizada micro-de alta resolución (micro-CT) se utilizó para evaluar las estructuras craneofaciales en 4 NSDTRs CP1 que eran homocigotos para la inserción LINE-1, y en 3 NSDTRs normales homocigóticos para el alelo de tipo salvaje.

Tomografía computarizada micro-de alta resolución (micro-CT) se utilizó para evaluar las estructuras craneofaciales en 4 NSDTRs CP1 que eran homocigotos para la inserción LINE-1, y en 3 NSDTRs normales homocigóticos para el alelo de tipo salvaje. [8]

journal.pgen.1004257.g002
Fuente: aquí

Conclusión

En resumen, la identificación de una mutación en un modelo de animal siendo el perro presentando defectos congénitos de origen natural ha permitido la identificación de nuevos genes en las personas, ayudando a comprender e informarnos más sobre este tema.

En relación a los animales es un estudio muy complejo llevando a cabo diferentes métodos de investigación, cumpliendo ampliamente con el objetivo de informar, presentar y llevar a cabo datos relevantes e informativos sobre este caso viéndose en mayor frecuencia en aquellos perros de razas con características braquicéfalos.

Referencias bibliográficas

1 Elena Galan Diaz, Anahí Ortiz Ruiz. Anatomía aplicada de los pequeños animales: Alteraciones en el paladar. Pag:2

[2]Jesús Fernández Sánchez;Fidel San Román Ascaso;Nicolás Israeliantz Gunz;Alejandra Galiñanes Plaza;Marta Pedraja Marqués; María de la Morena Cabanillas. Patología de la cavidad oral: Tratamiento quirúrgico del paladar hendido secundario congénito en perro. Pag: 2

[3]Terry Brown. (2008).Genome (3ra edición ).Editorial Medica Panamericana.

[4] Tratamiento quirúrgico del paladar hendido secundario congénito en perro. Hospital Clínico Veterinario Dr Jesús Mª Fernández Sánchez Facultad de Veterinaria. UCM. Madrid.

[5] Panganiban, G .; Rubenstein, JL (2002). “Funciones del Desarrollo de los genes homeobox distal-less / Dlx” Development (Cambridge, Inglaterra) 129 (19):.. Desde 4.371 hasta 4.386 PMID 12223397.

[6] “Entrez Gene: DLX5 distal-less homeobox 5”.

[7] Wolf ZT, Leslie EJ, Arzi B, Jayashankar K, Karmi N, Jia Z, et al. Published: April 3, 2014. A LINE-1 Insertion in DLX6 Is Responsible for Cleft Palate and Mandibular Abnormalities in a Canine Model of Pierre Robin Sequence. PLoS Genet 10(4): e1004257. doi:10.1371/journal.pgen.1004257

[8]- Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MA, et al. (2007) PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet 81: 559–575

Espero les haya gustado y les sirva a muchos otros en el camino de aprender

Saludos

Gaby

Neutropenia cíclica en Collies. Monografías de alumnos

collie gris

Nuevamente les dejo una monografìa de mi alumno Nicolás Cugliari  de 3er año de la carrera de Veterinaria de la Univ. Nacional de Río Negro, sobre una enfermedad hereditaria en caninos denominada NEUTROPENIA CICLICA EN CANINOS (Collies). Espero que les sirva a muchos otros en el camino del aprendizaje.

Neutropenia cíclica

Universidad Nacional de Río Negro
Genética Básica
2015 Cugliari Nicolás

Introducción

Neutropenia cíclica, también conocida como síndrome del Collie gris es una alteración autosómica recesiva, producida por la mutación del gen AP3B1 que afecta a la raza Collie. Se caracteriza por la disminución crítica en la cantidad de neutrófilos de manera cíclica. Esto deja vulnerable al animal al ataque de agentes bacterianos. Los animales afectados muestran una serie de signos y una dilución del color del pelaje que junto a técnicas de laboratorio permiten diagnosticar el desorden genético.

Enfermedad

La mutación provoca que las “stem cells” o células madre de la médula ósea funcionen de manera anormal. Este tejido se encarga de la formación y maduración de las células sanguíneas. Consecuentemente, esta afección genera trastornos en la producción de leucocitos. Entre estos, los más afectados son los neutrófilos, principales encargados de la fagocitosis y primeros defensores ante una infección. El recuento de neutrófilos en banda y segmentados puede dar 0 o un valor cercano. La actividad de los pocos neutrófilos circulantes se muestra desequilibrada e incapaz de cumplir sus funciones inmunológicas ante, principalmente, bacterias. Se ha observado que en ocasiones puede darse una disminución considerable de plaquetas, lo cual lleva a hemorragias. El número de otros glóbulos blancos puede disminuir sin tener grandes repercusiones. (Patt, et al. 1973.)
El proceso en perros infectados dura aproximadamente 20 días y se produce de manera repetitiva cada 2 a 10 días. El número de leucocitos se normaliza al cabo de una semana aproximadamente gracias a una serie de mecanismos de retoralimentación que tienen lugar en la médula ósea. (Dale, et al 1972)
La disminución de neutrófilos generada por este trastorno facilita el ingreso y la supervivencia de agentes bacterianos una vez dentro del perro. Por lo tanto, animales afectados son susceptibles a todo tipo de infecciones sobre todo bacterianas en piel, ojo y sistema respiratorio. (Lund, et al 1967)
Externamente la neutropenia cíclica genera una dilución en el color del Collie, alcanzando un color grisáceo y ocasionalmente beige.
Entre 8 y 12 semanas luego de nacer, los cachorros enfermos comienzan a manifestar los síntomas. Son de menor tamaño, más débiles y si no se los trata no llegan a superar el año de vida. Aún recibiendo el cuidado apropiado, es decir, siendo monitoreado y suministrado antibióticos, la expectativa de vida no supera los 4 años de vida. (Pacheco, et al 2008)

Herencia

La enfermedad solo afecta a perros que reciben dos copias del gen mutado, es decir, se hereda como recesivo. La misma puede manifestarse en algún punto de su vida. Los perros enfermos transmiten una sola copia de la mutación a sus descendientes.
A aquellos animales que tienen un solo gen mutado se los denomina portadores. No desarrollan la enfermedad pero tienen un 50% de probabilidad de transmitir una copia mutada del gen a sus descendientes.
Los perros que tienen dos genes normales son considerados libres, por lo tanto, no pueden trasmitir genes mutados ni desarrollar la enfermedad. A diferencia de los enfermos y portadores no manifiestan color gris plateado en el pelaje.
Gen AP3B1

El gen AP3B1 o adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit se encuentra en el cromosoma 3 del perro. Está formado por 25 intrones, 27 exones y una secuencia de nueve bases. Fue mapeado por medio de análisis de ligamiento de alta densidad. (Benson, et al 2004.)
Este codifica una subunidad del complejo proteico adaptador AP3, involucrado en el transporte de proteinas entre lisosomas y el complejo de Golgi, más específicamente, de la ELA 2 o neutrófilo elastasa. La subunidad del AP3 se asocia a la neutrófilo elastasa o ELA2 a través de una señal basada en la tirosina cerca a su extremo C-terminal y actuando como su transportador. (Meng, 2010.)

Mutación

La mutación consiste en la inserción de un residuo extra de adenina en una cadena de adeninas ubicadas en el exon 21 del gen AP3B1.
Perros heterocigota portadores, que tienen un alelo normal y uno mutado, producen una población homogénea de transcripciones normales del gen. En este caso contienen nueve adeninas en el alelo normal y diez en el mutado.
En el caso de perros homocigota afectados, que tienen dos alelos mutados, producen una población heterogénea de ARNm del AP3B1 conteniendo transcripciones mutadas con diez adeninas.
Las mutaciones en la subunidad beta del complejo A3 provocan inestabilidad del gen, haciendo que los neutrófilos de perros afectados tengan deficiencia en la elastasa. La deficiencia de ELA2 permite que se acumulen proteinas precursoras de la elastasa en sus gránulos primarios. (Meng, 2010)

Diagnóstico

El diagnóstico de la neutropenia cíclica se realiza mediante un hemograma que determine la disminución o en ocasiones ausencia de neutrófilos. Para ello se relacionan los signos manifestados y el color del pelaje.
El pelo sufre una dilución en el color tornándose gris plateado y puede que beige. Los animales enfermos presentan fiebre, diarrea, dolor en las articulaciones e infecciones cutáneas, oculares y respiratorias.
Para la detección de la mutación primero se obtuvo una secuencia parcial del cADN del gen AP3B1 para realizar un análisis northern-blot del ARN total extraído de la sangre del perro. La técnica llamada Northern-blot o ensayo Northern es similar al Southern-blot pero, este es utilizado en la detección de moléculas de ARN de una secuencia. Se toma una mezcla de ARN y se la somete a una electroforesis en gel. Se separan los fragmentos de acuerdo al tamaño y se los transfiere a una membrana cargada positivamente donde se produce la hibridación de una sonda molecular marcada radiactivamente. (Watson, 2004.)
La transcripción aparece ausente en el perro afectado y la mitad aproximadamente de la misma en portadores, comparándolos con animales de otras razas a modo de control.
A continuación se clonó completamente el cADN de AP3B1 aislando totalmente el ARN de la sangre del animal y realizando una carrera de 5’-3’. (Benson, KF., et al.)

Benson et. al, 2004
Benson et. al, 2004

Los perros afectados mostraron dos secuencias de transcripción que diferían por la presencia de un residuo de adenina extra en la secuencia de nueve adeninas. Posteriormente se determinó la secuencia genómica del AP3B1 por un recorrido en los intrones a partir de los exones identificados en el cADN. Esto permite establecer primers para la amplificación de la secuencia de adeninas en el gen AP3B1 a partir de ADN genómico. La misma se realiza utilizando la técnica de PCR o reacción en cadena de polimerasa. Esta consiste en la síntesis de ADN por medio de la ADN polimerasa de manera automatizada a partir de cebadores. El proceso se da por complementariedad de bases. (Benson, KF., et al.)
Los resultados determinaron que Collies afectados son homocigota y los portadores heterocigota debido a la inserción de una adenina adicional en la secuencia de nueve adeninas. Dicha secuencia se ubica en el exon 21 del gen AP3B1.
La aparente auscencia de la transcripción del alelo mutado en heterocigotas es el resultado de una degradación selectiva de transcripciones mutadas.

Neutropenia
Benson et al 2004

Tratamiento

La neutropenia cíclica puede ser curada por medio de transplante medular. Estos sin embargo, resultan poco práctico, limitándose el tratamiento solo a monitoreos y administración de antibióticos. Sin embargo, a pesar de los cuidados, los perros enfermos no superan los cuatro años de vida.

Referencias

  • Benson, KF., Person, RE., Li, FQ., Williams, K., Horwitz, M. 1. 2004.
    Paradoxical homozygous expression from heterozygotes and heterozygous expression from homozygotes as a consequence of transcriptional infidelity through a polyadenine tract in the AP3B1 gene responsible for canine cyclic neutropenia. Nucleic Acids Res 32:6327-33, 2004. Pubmed reference: 15576359. DOI: 10.1093/nar/gkh974.
  • Benson, K.F., Li, F.Q., Person, R.E., Albani, D., Duan, Z., Wechsler, J., Meade-White, K., Williams, K., Acland, G.M., Niemeyer, G., Lothrop, C.D., Horwitz, M. 2. 2003
    Mutations associated with neutropenia in dogs and humans disrupt intracellular transport of neutrophil elastase Nature Genetics 35:90-6, 2003. Pubmed reference: 12897784.
  • Dale, D.C., Alling, D.W., Wolff, S.M. 1972
    Cyclic hematopoiesis: the mechanism of cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Journal of Clinical Investigation 51:2197-2204, 1972. Pubmed reference: 5054472. DOI: 10.1172/JCI107027.
  • Lund, J.E., Padgett, G.A., Ott, R.L. 1967.
    Cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Blood 29:452-461, 1967. Pubmed reference: 6067150.
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