Actividad de aprendizaje de Marcadores Moleculares: Detección de un defecto genético en bovinos mediante pruebas de ADN

Introducción: El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN han permitido conocer el origen de algunas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnóstico precoz. Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras nucleadas y técnicas de amplificación in vitro y digestión con enzimas de restricción se puede diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad es posible estudiar enfermedades hereditarias del ganado bovino lechero como la deficiencia de adhesión leucocitaria bovina (BLAD).

La deficiencia en la capacidad de unión de leucocitos bovinos a los antígenos, más conocida como BLAD (Bovine Leuckocyte Adhesion Deficiency), es causante de la muerte de animales de la raza Holstein a los pocos meses de nacer (de 2 a 8 meses) debido a una susceptibilidad aumentada a la acción de agentes infecciosos. Su principal característica es ser una enfermedad autosómica recesiva que puede ser transmitida a la descendencia.

Se conoce la secuencia del gen normal que codifica para la subunidad β de las integrinas de la proteína bovina CD18 y se ha identificado el alelo bovino CD18 defectuoso.

La amplificación del ADN mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) específica para dicho locus, y posterior digestión del fragmento amplificado (101 bp) en forma separada con las enzimas de restricción Taq I y Hae III, permite visualizar en gel de agarosa al 4% los fragmentos de restricción.

En base al esquema de la Fig. 1, completar el cuadro 1 con el tamaño de los fragmentos de restricción esperados para muestras obtenidas de animales sanos (TL), portadores (BL) y enfermos (BLAD).

Patron de restricción alelos BLAD.jpg

        Figura 1. ADN amplificado y efecto de la digestión con enzimas de restricción

 

Cuadro 1. Patrón de las bandas de los fragmentos de restricción (pb) posterior a la digestión con enzimas Taq I y Hae III.

Tabla para completar ejercicio 1.jpg

 

ACTIVIDAD RESUELTA

La amplificación por PCR tanto del gen CD18 normal y su alelo defectuoso resulta en un fragmento de 101 pares de bases (pb). Sabemos, además, que hay tres genotipos/fenotipos posibles:

  • TL/TL= homocigota (Normal);
  • TL/BL= Heterocigoto (Normal, portador); 
  • BL/BL= Homocigoto (enfermo)

Fig 1 Resoluc.jpg

esquema de restriccion

Por lo que sí, posterior a la amplificación, el producto de 101 pares de bases se somete a digestión con Hae III, el alelo BL se corta en 3 fragmentos: 46, 19 y 36 pares de bases. En cambio, el alelo normal, TL, solo se corta en 2 fragmentos: 65 y 36 pares de bases.

Imagen1

Por lo que sí, posterior a la amplificación, el producto de 101 pares de bases se somete a digestión con Taq I, el alelo BL se corta en 2 fragmentos: 84 y 17 pares de bases. En cambio, el alelo normal, TL, solo se corta en 3 fragmentos: 52, 32 y 17 pares de bases.

En base al análisis previo de cómo se fragmentan cada uno de los alelos con ambos tipos de enzimas, podemos completar el Cuadro 1.

Cuadro 1. Patrón de las bandas de los fragmentos de restricción (en pares de bases) posterior a la digestión con enzimas Taq I y Hae III.

cuadro 1 resuelto.jpg

Recordar que las bandas migran en el gel de agarosa en función de su peso: Las de mayor pesa se ubican en la parte superior del gel, o lo que es lo mismo, más próximos al pocillo de siembra. Recordar sembrar un marcador de Peso Molecular que permita identificar el tamaño de las bandas.

Como ejemplo, se explica en detalle como completar las columnas 2, 3 y 4, en la que se usa Taq I.

  • Un individuo homocigota normal, es decir, genotipo TL/TL: de cada alelo se amplifica idéntica secuencia, por poseer copias idénticas del gen, por lo que la digestión del ADN dará solamente las bandas de tamaño: 52, 32 y 17 pares de bases.
  • Un heterocigota portador, es decir, genotipo TL/BL: de cada alelo se amplifica distinta secuencia, por lo que la digestión del ADN dará una mezcla de las bandas obtenidas de la digestión del alelo TL (52, 32 y 17 pares de bases) y del alelo BL (84 y 17 pares de bases), es decir, en total se observarán CUATRO BANDAS: 84, 52, 32 Y 17 pares de bases (el fragmento de 17 pares de bases es común a ambos alelos).
  • Un homocigota Enfermo, es decir, genotipo BL/BL: de cada alelo se amplifica idéntica secuencia, ya que es homocigota, por lo que la digestión del ADN dará solamente las bandas de tamaño: 84 y 17 pares de bases.
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Talasemia. Monografías de alumnos

Hoy quería dejarles la monografìa realizada por Mariana de Gregorio acerca de la Talasemia. Espero esto les sirva a todos los que busacn información del tema

Saludos

Gaby

 

Trabajo final de

Genética básica.

TALASEMIA.

 

Alumna: Mariana De Gregorio Paolasini.

Profesora: Gabriela Iglesias.

Fecha: 3 de Noviembre del año 2015.

Universidad: Nacional de Rio Negro.

Curso:  Genetica básica, Tercer año.

Carrera: Medicina veterinaria

 

Introducción:

En la sangre encontramos distintos tipos celulares, entre ellos, los eritrocitos, los cuales representan el número más abundantes de células  de la sangre, y que tienen como componente principal la hemoglobina , cuya función es transportar el oxígeno hacia los diferentes tejidos del cuerpo.  Participa en el proceso por el que la sangre lleva los nutrientes necesarios hasta las células del organismo y conduce sus productos de desecho hasta los órganos excretores. También transporta el oxígeno desde los pulmones (o desde las branquias, en los peces), donde la sangre lo capta, hasta los tejidos del cuerpo.

Los eritrocitos son producidos continuamente en la médula ósea de los huesos largos principalmente.  Tienen una forma oval, bicóncava, aplanada, con una depresión en el centro; diseño óptimo para el intercambio de oxígeno con el medio, ya que le otorga flexibilidad para poder atravesar los capilares, donde liberan la carga de oxígeno.

El diámetro de un eritrocito típico es de 6-8 µm.

Los valores considerados normales de eritrocitos en adultos son:
  • Mujeres: 4 – 5 x 106/mL(mililitro) de sangre
  • Hombres: 4,5 – 5,5 x 106/mL(mililitro) de sangre. wikipedia.org,. (2015).

Un  déficit o disminución por debajo del rango de referencia de los eritrocitos  genera un estado patológico  denominado anemia,  cuya  alteración provoca hipoxia tisular. En cambio, un exceso de estos, se denomina policitemia, el aumento de la concentración de eritrocitos (eritrocitosis) es una patología mucho menos común.

Existen  alteraciones en la maduración de los eritrocitos, entre las cuales están la deficiencia de hierro y las anomalías genéticas que conducen a la producción de hemoglobinas anormales.

Entre las patologías que se pueden producir por anomalías genéticas esta la talasemia, trastorno sanguíneo hereditario.

En este trabajo se explicara que es la talasemia, se nombraran sus variedades, haciendo hincapié en una en particular, llamada β-talasemia, dentro de la que encontramos más de 200 tipos de mutaciones, de las que se explicaran las  más frecuentes en nuestro país.

Desarrollo:

En un sujeto normal, los glóbulos rojos tienen una duración de 120 días de vida. Cada día, el cuerpo produce nuevos glóbulos rojos para reemplazar los que han muerto o los que el cuerpo ha perdido.  En la talasemia, los glóbulos rojos se destruyen a una velocidad mayor generando anemia.

La talasemia ¨Es un trastorno sanguíneo que se transmite de padres a hijos (hereditario) en el cual el cuerpo produce una forma anormal de hemoglobina, la proteína en los glóbulos rojos que transporta el oxígeno¨. (Policlinicalacibis.es,. 2015).

Esta hemoglobina está compuesta por cuatro cadenas de polipeptidos, dos cadenas de globina alfa y dos cadenas de globina beta. Por lo que hay dos tipos de talasemia principales – talasemia alfa y talasemia beta – cuyo nombre viene de los defectos que pueden ocurrir en estas cadenas de proteínas.

Hay dos copias del gen que produce la hemoglobina α (HBA1 y HBA2), y cada uno codifica una cadena α, y ambos genes están localizados en el cromosoma16. El gen que codifica las cadenas β (HBB) está localizado en el cromosoma 11.  (Es.wikipedia.org,. 2015). 

 

 

hemo2

Figura 1: Molécula de hemoglobina. Estructura cuaternaria de globinas. Fundrepa.org

Lo que genera las siguientes patologías:

  1. Alfa talasemia:cuando el cuerpo tiene dificultades produciendo alfa globina
  2. Beta talasemia:cuando el cuerpo tiene dificultades produciendo beta globina

En la α-talasemia, el gen HBA1  y HBA2, del cromosoma 16,  hay una deficiencia de síntesis de cadenas α. El resultado es un exceso de cadenas β que trasportan deficientemente el oxígeno, lo que conduce a bajas concentraciones de O2 (hipoxemia).

Paralelamente, en la β-talasemia  hay una falta de cadenas β, y el consiguiente exceso de cadenas alfa, que puede formar agregados insolubles que se adhieren a la membrana de los eritrocitos, pudiendo causar la muerte de éstos y sus precursores, originando anemia de tipo hemolítico.

Estas compensaciones  dan lugar a la formación de hemoglobinas inestables que provocan la destrucción de los glóbulos rojos y por lo tanto anemia. (Es.wikipedia.org,. 2015).

La talasemia se transmite de manera autosómica recesiva, afectando a los varones y mujeres igualmente, pues no implica el cromosoma de sexo  y se da cuando existe un defecto en un gen que ayuda a controlar la síntesis de una de las proteínas globulina  alfa o globulina beta  que componen la hemoglobina.

Sin título

Google.com.ar,. (2015)

 

Como se explico anteriormente, hay diversas formas de talasemia y cada tipo tiene muchos subtipos diferentes. Tanto la talasemia α como la talasemia β,  abarcan las siguientes dos formas, dependiendo la severidad de los síntomas:

  1. Talasemia menor.
  2. Talasemia mayor.

La talasemia menor se presenta  si uno recibe  el gen defectuoso  de solo uno de los padres. Las personas con esta forma de trastorno  son portadoras de la enfermedad y por lo general no tienen síntomas. En cambio, es necesario heredar el gen defectuoso de ambos padres para padecer la talasemia mayor.

Esta enfermedad está provocada por deleciones en uno o varios genes de los que componen los grupos de la α-globina y la β-globina. Según la cantidad de deleciones,  el tipo de talasemia será más o menos grave.

Existen otras deleciones  como resultado de entrecruzamientos desequilibrados entre los segmentos duplicados presentes en la región de la agrupación. (Es.wikipedia.org,. 2015).

Entrecruzamiento_desequilibrado (1)

Imagen de entrecruzamiento desequilibrado. Upload.wikimedia.org,. (2015)

 

Talasemia alfa:

La talasemia alfa ocurre cuando un gen, o los dos genes relacionados con la proteína globina α  de la hemoglobina faltan o se han modificado, mutado.  La alfa globina se genera en el cromosoma 16, por lo tanto, si los dos genes que le indican al cromosoma 16 que produzca alfa globina no se encuentran o han mutado, se produce menos alfa globina. Esto afecta la hemoglobina y disminuye la capacidad de los glóbulos rojos de transportar oxígeno por el cuerpo.

 

 

“Se necesitan cuatro genes, dos de cada padre, para hacer cadenas de proteína alfa. Cuando faltan uno o más de los genes, se produce la talasemia alfa. Este gráfico describe los diferentes tipos de talasemia.”

 

Genes alfa que faltan Problema Síntomas de anemia Otros nombres
1 Portador silencioso Ninguno Talasemia alfa – 2 rasgos, talasemia alfa mínima
2 Rasgos Leve Talasemia alfa – 1 rasgo, talasemia alfa menor
3 Hemoglobina H Moderados Enfermedad de la hemoglobina H
4 Seria Mortal Hidropesía fetal con la Hemoglobina de Bart

Clevelandclinic.org,. (2015).

 

  • Portador silencioso de alfa talasemia: un alelo del gen de la cadena alfa está delecionado (los otros tres son normales).  Genotipo  -/α α/α
  • Portador de alfa talasemia:perdida de dos alelos α, de los genes de cadena alfa, cualquiera ambos del mismo cromosoma 16, llamaron una canceladura de los “cis” o uno de ambos cromosomas 16, llamado una canceladura “trans.” Genotipo: -/- α/α or -/α -/α.
  • Enfermedad de la hemoglobina H: perdida de tres alelos α de los dos  genes de la cadena alfa están delecionados. La enfermedad de la hemoglobina H, produce una anemia. Las personas que tienen la enfermedad de la hemoglobina H corren un mayor riesgo de tener un hijo con alfa talasemia grave, puesto que son portadores de un cromosoma número 16 con dos genes delecionados de la cadena alfa (deleción en cis). Genotipo: -/- -/α
  • Alfa talasemia grave:pérdida de los cuatro alelos α, de ambos  genes de la cadena alfa, lo que es tan grave que puede producirse la muerte dentro del útero (antes del nacimiento). Genotipo: -/- -/-

Todos los casos posibles de talasemia alfa, según la ausencia de uno, dos, tres o cuatro genes de la alfa globina. Es.wikipedia.org,. (2015).

 

 

Ventajas de la talasemia α:

La α-talasemia protege a los individuos que la portan frente a la malaria. La malaria o paludismo está producida por un parásito protista del género Plasmodium y es transmitida por un mosquito del género Anopheles. La protección frente a esta enfermedad por parte de los individuos que posee α-talasemia es debida a que Plasmodium sólo es capaz de parasitar a los eritrocitos sanos. Sin embargo, la sangre de alguien con este tipo de anemia presenta un número elevado de eritrocitos deformes por culpa de que la hemoglobina no está bien constituida y eso es esencial pues deja al parásito indefenso en la sangre permitiendo que nuestro sistema inmunitario acabe con él.

 

Talasemia Beta

Normalmente hay dos genes de globina beta, uno heredado  de cada padre. La talasemia beta es un cambio en uno o los dos genes de globina beta, localiza en el cromosoma 11. Las mutaciones pueden suprimir completamente (mutaciones β0) o disminuir (mutaciones β+ y β++) la producción de cadenas β globina, lo que resulta en un desequilibrio en la síntesis de cadenas de globina α/β.

La magnitud de este, es la determinante principal del fenotipo de la enfermedad, que abarca desde los individuos asintomáticos (β-Talasemia  menor o portador) que agrupa a los genotipos heterocigotos (β+/P o β0/P) y que corresponde a la forma más frecuente en nuestro país,  hasta los que dependen de transfusiones regulares para vivir (β talasemia mayor) que comprende a los genotipos homocigotos (β00 y β++) o dobles heterocigotos (β0+), y corresponde a las formas de mayor expresividad clínica.

Entre ambos extremos, se encuentran los pacientes con β talasemia intermedia (BTI), en los cuales las manifestaciones clínicas son variables.

 

Este gráfico describe los diferentes tipos de talasemia beta.

 

Genes beta afectados Problema Síntomas de anemia Otros nombres
1 Portador silencioso Leve
1 Rasgo Leve
2 Intermedia Moderado
2 Mayor Severo Anemia de Cooley

Clevelandclinic.org,. (2015).

 

También existen casos de deleciones de diversos tamaños que pueden afectar al gen de la beta globina o a la región de control del locus.

Mayoritariamente es una enfermedad hereditaria con un patrón autosómico recesivo, pero también existen algunos casos donde la herencia es autosómica dominante.

También existen dos variedades de beta-talasemia (mayor o menor) según sea un déficit total o parcial de la síntesis (dependiendo la severidad de los síntomas): la talasemia mayor (también conocida como anemia de Cooley o anemia del mediterráneo) que es más severa y la talasemia intermedia.

Beta talasemia grave o MAYOR u homocigota (anemia de Cooley): los dos genes de la cadena beta tienen deleciones, causando el tipo más grave de beta talasemia. Los pacientes que tienen talasemia grave pueden fabricar suficientes glóbulos rojos  por lo que necesitan frecuentes transfusiones de sangre y puede que no vivan mucho tiempo. Durante el primer año o dos primeros años de vida, pueden estar pálidos, irritables, tener poco apetito y padecer muchas infecciones. Sin tratamiento, aumenta el tamaño del hígado, del bazo y del corazón, y los huesos pueden volverse delgados y quebradizos, desarrollan hemosiderosis (depósito en todos los tejidos del hierro liberado tras la hemólisis). Es frecuente la presencia de cálculos biliares por la hemólisis crónica. Adquieren un color pardo-verdoso por la anemia, la ictericia (la hemólisis libera bilirrubina que produce un color amarillo en la piel y mucosas) y la hemosiderosis. Se detiene el crecimiento, se retrasa la pubertad. Y finalmente se produce un fallo cardíaco.

Actualmente algunos pacientes pueden también ser tratados, e incluso curados, mediante un transplante de médula ósea.

 

Beta talasemia leve o característica de talasemia – un gen beta tiene una deleción, provocando anemia. La talasemia leve se divide en:

1.-Talasemia mínima  (la persona tiene pocos o ningún síntoma).

2.-Talasemia intermedia  (la persona tiene una anemia de moderada a grave).

 

-Beta Talasemia Intermedia: Se designa así al síndrome talasémico de moderada intensidad, que condiciona la aparición de una anemia leve y alteraciones óseas. Presentan sintomatología clínica y requieren transfusiones de sangre durante alguna época de su vida, pueden desarrollar hemosiderosis. Sus manifestaciones no son tan graves como en los pacientes afectados de la forma mayor de la enfermedad.

-Beta talasemia heterocigota o menor (rasgo talasemico): aparece cuando sólo está afectada una de las copias del gen que codifica la cadena. Es la mutación del gen beta, caracterizada por unos hematíes elevada, con concentración de hemoglobina normal o disminuida y generalmente presenta un aumento de la Hb A2. Las personas portadoras de talasemia menor, no presentan manifestaciones clínicas, aunque en ocasiones pueden tener una ligera anemia que se pone de manifiesto al realizar un análisis. Los glóbulos rojos de los portadores del rasgo talasémico son más pequeños de lo normal. La talasemia menor está presente desde el nacimiento, permanece durante toda la vida y puede transmitirse de los padres a los hijos.

Las β-talasemias además de la deleción del gen de la β-globina, también pueden darse por otras causas como:

  • Mutaciones en el promotor que detienen o reducen su transcripción.
  • Mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) que impiden la eliminación de losintrones.
  • Mutaciones en el sitio aceptor de poli-A que afectan al procesamiento del mesnajero ó mRNA.
  • Mutaciones de cambio en la pauta de lectura.

Es.wikipedia.org,. (2015).

O también pueden presentarse otras formas de talasemia beta cuando se hereda un gen para la beta talasemia en combinación con un gen de una variante hemoglobínica. Las más importantes son:

  • HbE: Si se hereda un gen de la HbE y uno de la beta talasemia, esta combinación es la responsable de la HbE-beta talasemia, apareciendo una anemia de moderada a severa similar a la beta talasemia intermedia.
  • HbS: beta talasemiaanemia falciforme. Si se hereda un gen de la HbS y otro de la beta talasemia, aparece la HbS-beta talasemia. es,. (2015).

 

Diagnostico para un paciente talasemico:

El diagnostico se puede realizar  con una única muestra de sangre, realizando:

  • Cuadro Hemático Completo (CBC), que incluye la medición de la hemoglobina y la cantidad/ tamaño de células rojas. La gente que sufre de talasemia tiene menos cantidad de células rojas sanas, menos hemoglobina de lo normal y dichos eritrocitos serán más pequeños e irregulares. (hemograma completo).
  • Un recuento de reticulocitos (medición de células rojas jóvenes) puede indicar que tu médula espinal no está produciendo el número adecuado de células rojas.
  • Los estudios del hierro indicarán si la causa de la anemia es una deficiencia de hierro (anemia ferropenica) o talasemia.
  • Se pueden usar pruebas genéticas o análisis mutacional para diagnosticar cuando hay un historial familiar de talasemia.
  • Electroforesis de la hemoglobina: es unprocedimiento de laboratorio que diferencia los tipos de hemoglobina presentes.
  • El médico lleva a cabo un examen físico para buscar un bazo inflamado (agrandado).

 

DIAGNOSTICO MOLECULAR- PCR:

El PCR es un método sencillo para el clonaje in vitro de cualquier segmento de ADN permitiendo disponer de forma rápida, eficaz y económica, de cantidades suficientes del mismo para su  posterior estudio molecular. Mediante esta  técnica, se realiza  la detección de los genotipos causantes de β-talasemia, ya que permiten discriminar entre alelos normales y mutantes que difieren en una sola base.

El método Amplificación Refractaria de Sistemas de Mutaciones (ARMS-PCR) es una modificación de la técnica de PCR,  utilizada para la detección de mutaciones puntuales causantes de β-talasemia. Esta técnica permite la amplificación enzimática de alelos específicos, mediante el uso de cebadores que están diseñados para discriminar entre secuencias que difieren en una única base. Además, utiliza cebadores control que amplifican otra región del gen de β globina, cercana a la mutación que será detectada, actuando como control interno de amplificación asegurando la eficiencia de la PCR y evitando falsos negativos.

Este es un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa, capaz de detectar diversas mutaciones puntuales y pequeñas deleciones o inserciones en el gen β globina, con el empleo de oligonucleótidos de secuencia específica.

 

 

Los productos obtenidos en la amplificación (PCR)  pueden analizarse mediante diversas técnicas:

 

https://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=imgres&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjpnaK939zJAhXKGJAKHZ3FB_EQjRwICTAA&url=http%3A%2F%2Fslideplayer.es%2Fslide%2F138610%2F&psig=AFQjCNGlrHnc5wtOs65GHix5t_7SlnCBIQ&ust=1450230428015774

  • Dot blot: se utiliza para detección de mutaciones puntuales mediante muestras de ADN hibridadas con sondas marcadas radiactivamente específicas de ciertas regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la región de interés se revelan (puntos oscuros).

 

  • Visualización del producto en geles de agarosa o poliacrilamida: se utiliza para separar los fragmentos de DNA basado en su tamaño.

http://slideplayer.es/slide/138610/

  • Análisis con enzimas de restricción: Las enzimas de restricción o endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
  • Secuenciación directa del ADN amplificado: determinación del orden de los nucleótidos (ACG y T) en un oligonucleótido de ADN

 

Las mutaciones más frecuentes en la población argentina del gen de β-globina son CD39 e IVS1-110, las cuales se dan a conocer mediante la técnica de ARMS-PCR.

  • IVS-I-110 (G>A)
  • CD 39 (C>T),

El diagnóstico molecular de β-talasemia, puede ser útil para brindar el asesoramiento genético entre parejas portadoras. La técnica de ARMS-PCR, reúne los requisitos necesarios de los métodos de diagnóstico: alta especificidad, reproducibilidad y bajo costo. Por lo tanto constituye un método eficaz para el diagnóstico de β-talasemia en pacientes sin posibilidad de estudio familiar, debido a la falta de uno de los padres.

Esta técnica no sólo permite detectar la mutación causante del padecimiento, sino también determinar si se encuentran en estado homocigoto o heterocigoto.

Los pacientes portadores de éstas (hetrerocigotos β/ βCD39 y β/βIVS1-110) y otras mutaciones β-talasémicas, son generalmente (salvo complicaciones) asintomáticos. Sin embargo, en estado homocigótico producen cuadros clínicos de mayor gravedad (Anemia de Cooley). De aquí la importancia de detectar a los individuos portadores, y en especial, aquellas parejas con probabilidades de concebir hijos con talasemia mayor, teniendo en cuenta las complicaciones que conlleva la herencia de dicha condición.  (Qbpatologica.files.wordpress.com,. 2015).

Tratamiento:

Los tratamientos estándar para los pacientes con talasemias serias son las transfusiones de sangre, quelación de hierro, extirpación del bazo, dosis diarias de ácido fólico, posible extirpación quirúrgica de la vesícula biliar, y trasplante de médula.

  • Las transfusiones de sangre cada 4 meses en los pacientes con talasemias moderadas o severas, y cada 2 a 4 semanas para los pacientes con talasemia seria beta. Se pueden necesitar transfusiones ocasionales para la enfermedad de la hemoglobina H o la talasemia intermedia beta.
  • La quelación del hierro: extirpación del exceso de hierro del cuerpo. Uno de los riesgos de las transfusiones de sangre es que pueden causar una sobrecarga de hierro, que a su vez puede causar enfermedades del corazón.
  • Esplenectomía(extirpación del bazo)
  • El trasplante de la médula espinal
  • Terapia génica: para lograr que un gen normal se inserte en un genoma del individuo con dicha enfermedad hereditaria.

Factores de riesgo:

  • Etnicidad afroamericana, asiática, china o mediterránea.
  • Antecedentes familiares del trastorno.

 

Incidencia

Las talasemias alfa ocurren con mayor frecuencia en personas del sudeste asiático, Medio Oriente, China y en aquellas de ascendencia africana. Las talasemias beta ocurren en personas de origen mediterráneo, y en menor grado, los chinos, otros asiáticos y afroamericanos.

 

Conclusión:

Luego de llevar a cabo la presente monografía,  se pude considerar que la talasemia es una enfermedad muy distribuida por el mundo, muy poco conocida por la población, aunque con una gran incidencia.

Estando al tanto de la gran distribución mundial de esta enfermedad, y la gran variedad de formas en las que se puede presentar,  es importante dar a conocer la misma, y que sean detectados y alertados por sus médicos aquellos individuos portadores,  en especial, aquellas parejas con probabilidades de concebir hijos con talasemia mayor, teniendo en cuenta las complicaciones que conlleva la herencia de dicha condición.


 

Bibliografía:

·   Bragos, M. (2015). Diagnostico molecular: aplicaciones en hemoglobina.. [online] Available at: https://fundatal.files.wordpress.com/2011/07/diagnostico-molecular-dra-bragos.pdf  [Accessed 15 Nov. 2015].

·   Clevelandclinic.org,. (2015). Las Talasemias. Retrieved 14 November 2015, from http://www.clevelandclinic.org/health/shic/html/s14508.asp

·   Es.wikipedia.org,. (2015). Eritrocito. Retrieved 15 November 2015, from https://es.wikipedia.org/wiki/Eritrocito

·   Exactas-unam.dyndns.org,. (2015). Retrieved 16 November 2015, from http://exactas-unam.dyndns.org/recyt/images/stories/Descargas/Rev14/6_acosta.pdf

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·   Scielo.org.ar,. (2015). Retrieved 15 November 2015, from http://www.scielo.org.ar/pdf/recyt/n14/n14a06.pdf

 

Parálisis Periódica Hiperkalémica (HYPP) en equinos. Monografías de alumnos

En esta ocasión les dejo la monografìa realizada por la alumna Betiana Tscherig acerca de la  Parálisis Periódica Hiperkalémica (HYPP) en equinos y su forma de diagnóstico por técnicas de biología molecuar. Espero les sirva a todos aquellos en el camino de aprender y los interesados en aprender sobre el tema

Saludos

Gaby

Tscherig. Imagen 2

Escuela de Medicina Veterinaria y Producción agroindustrial.

Parálisis Periódica Hipercalémica (HYPP) en Equinos.

Curso de Genética básica a cargo de Iglesias, Gabriela, año 2015.

Alumna Tscherig Betiana.

 

Parálisis periódica hipercalémica (HYPP) en equinos.

 

Con la presente monografía se darán a conocer con detalles, aspectos propios de la Parálisis Periódica Hipercalémica (HYPP) haciendo especial hincapié en el área genética. Se trata de una enfermedad genética de tipo autosómica dominante presente en los equinos que básicamente afecta los canales de sodio en las células del músculo y la capacidad para regular los niveles de potasio en la sangre.

Esta enfermedad presenta una amplia variedad de síntomas clínicos y se generalizó cuando los criadores trataron de producir caballos con musculatura pesada. Hipótesis que posteriormente se descartó.

Se debe tener presente que dicha afección no solo se produce en equinos sino que también lo hace en los seres humanos, en los cuales se denomina Gamstorp adynamy episódica.

Características propias de la Parálisis Periódica Hipercalémica.

 

Herencia.

La Parálisis Periódica Hipercalémica es una enfermedad muscular que se presenta en los descendientes del semental  Cuarto de Milla “Impressive” (AQHA 767246), oriundo Oklahoma, Estados Unidos. El semen de este equino fue seleccionado y utilizado de manera intensa gracias a las cualidades de conformación de dicho semental, desconociendo aún la mutación. Tal es así que a partir del año 2003 se registraron más de 55.000 equinos vivos relacionados en su genealogía con Imprenssive (según registros de la AQHA), pero se sabe que contribuyó a la composición genética de 2.9 millones de caballos registrados (Rudolph et al., 1992).

En la actualidad se dice que la Parálisis Periódica Hipercalémia equina se presenta en 1 de cada 50 caballos cuarto de milla. También se ha reportado su presencia en varias líneas de caballos tales como Apaloosa y Pintos (Church 1995, Rudolph et a/, 1992).

En 1996, el Dr. Naylor sugirió como hipótesis que las anomalías en la transmisión del potencial de membrana de los caballos HYPP-positivo podrían conducir a la hipertrofia muscular característica en esta línea. Doctores expertos de la Universidad de California Davis y de la Universidad de Valberg, Minnesota, llevaron a cabo los análisis musculares para apoyar o refutar esta hipótesis mediante biopsias del músculo glúteo pero no encontraron ninguna diferencia en cuanto al porcentaje de contracción, edades o tamaño de las fibras y ninguna asociación con la gravedad clínica. Por lo tanto, su investigación descartó la hipótesis del Dr. Naylor.

 

Características genéticas.

La parálisis periódica hipercaliémica (HYPP) es una enfermedad genética de herencia autosómica dominante, es decir que es requerida una sola copia del gen (alelo) para que se presente la enfermedad.

Durante un estudio genético llevado a cabo en Stichting Klinisch Genetisch Centrum de Leiden (Holanda) en humanos se determinó que la enfermedad está causada por mutaciones en el gen SCN4A, que codifica la subunidad alfa (α) del canal de sodio muscular o canal de tipo IV. Se trata de una proteína transmembrana de 1.836 aminoácidos que, junto a la subunidad beta (β) del canal, media la permeabilidad de las membranas musculares excitables a los iones de sodio. El canal adopta conformaciones abiertas o cerradas en función de las diferencias de voltaje y el sodio pasa a través del poro de acuerdo con su gradiente electroquímico. El gen, que tiene 24 exones y se localiza en el cromosoma 17q23.3, fue identificado como la causa de la enfermedad mediante cartografía genética y análisis mutacional. (B. Narberhaus; 2008)

Normalmente para evitar que el músculo se contraiga continuamente, el canal de sodio se cierra mediante su compuerta de inactivación rápidamente después de que se abra y tome contacto con el ion. Con el tiempo, los iones de potasio salen de las células musculares, repolarizando así a las células y provocando el bombeo de calcio fuera del aparato contráctil para relajar el músculo. (Ganong, 2010)

Mediante el estudio génico de Narberhaus y otros investigadores, se determinó además que se presenta un cambio en heterocigosis, una transición nucleotídica de Citocina a Timina en el exón 13 del gen, que resulta en una sustitución aminoacídica de treonina (Thr) a metionina (Met) en el residuo 704 de la proteína (c.2111C>T, p.Thr704Met).

En cambio, en el equino esta mutación de punto consiste en una sustitución de Citosina a Guanina en el gen que codifica el dominio transmembranal de la sub-unidad alfa del canal de sodio muscular. El intercambio de citosina por guanina de la proteína SCN4A resulta en la sustitución de un residuo fenilalanina por leucina el cual es más pequeño que el residuo de la fenilalanina, resultando fisiológicamente o electroquímicamente en la fuga del ion sodio, a través del poro de la membrana celular que debería permanecer cerrado cuando no está bajo estimulación nerviosa (que generaría una contracción muscular) (Reynolds, 1997). La mutación en esta especie fue aislada en 1994 por investigadores de la Universidad de Pittsburgh, con una subvención de diversas organizaciones de equinos; los mismos desarrollaron un análisis de sangre el cual es utilizado actualmente para la identificación de los individuos afectados.

Las mutaciones, alteran la estructura normal y la función del canal de sodio e interrumpen de este modo la regulación de la contracción muscular, originando así cierta susceptibilidad a los episodios de parálisis del mismo.

“La sustitución aminoacídica impide la inactivación del canal que sigue normalmente a un potencial de acción, dando lugar a un flujo incontrolado de sodio hacia el interior de la fibra muscular. Como consecuencia, la fibra se despolariza activando la entrada de calcio desde el retículo sarcoplasmatico para causar la contracción del músculo, impidiendo la generación de nuevos potenciales de acción. La entrada masiva de sodio dentro de las células provoca una salida de potasio que explica los niveles aumentados de este catión en sangre que son característicos de la enfermedad.” (B. Narberhaus; 2008)

El fallo de los canales de sodio para inactivar correctamente se ve favorecido frente a  factores como el estrés o cuando los niveles de potasio en la sangre fluctúan. Esto último puede ocurrir con el ayuno seguido por el consumo de un alimento rico en potasio, como la alfalfa. (ucdavis.edu., 2015)

Descendencia.

Desde el año 1998, la AQHA (American Quarter Horse) exige revelar la condición genotípica de la HYPP en los documentos de registro de todos los potros que descienden de alguna línea genética identificada como portadora del gen portador. Si un potro y sus progenitores no han sido analizados para el gen HYPP, los documentos de registro deberán llevar la leyenda: “Este caballo tiene un ancestro conocido como portador del gen HYPP, designado de a cuerdo a las reglas de la AQHA como un defecto genético. La AQHA recomienda realizar el examen respectivo para confirmar la presencia o ausencia de este gen” (Crabbe, 1998).

Según los resultados de los análisis realizados a los equinos para el gen HYPP el documento de registro del animal llevará la designación “N/N”, “N/H” o “H/H”. (Ayala, M., 2005)

Homocigota recesivo: N/N. resulta negativo para la enfermedad, lo cual significa que no es portador del gen HYPP y por ende no lo transmiten, aunque sean descendientes de Impressive.

Heterocigota: N/H. si tiene una copia o alelo del gen el caballo resulta positivo a la mutación. Estos caballos se ven afectados en un grado menor.

Homocigota dominante: H/H. Si tiene dos alelos del gen. Darán lugar a toda la descendencia que lleva el gen defectuoso, independientemente del estado del otro progenitor. El fenotipo se muestra como severamente afectado.

Se concluye con esto que los animales homocigótos para la mutación (H/H) son severamente más afectados que los heterocigótos (N/H) (Beech et al., 1993) y por esto se deben de tener en cuenta las siguientes posibilidades de apareamiento:

  • Un equino (♂ o ♀) heterocigótico para la mutación (N/H), tiene un 50% de probabilidad de transmitir una copia del gen anormal (H) a su descendencia cuando es apareado con un equino normal (N/N) mientras que el otro 50% lleva la mutación (N/H).
  • Un equino (♂ o ♀) heterocigótico para la mutación (N/H), tiene un 75% de probabilidad de procrear un potro con HYPP (50% N/H; 25% H/H), cuando es apareado con otro equino también heterocigótico (N/H)
  • Un equino (♂ o ♀) homocigótico para la mutación (H/H), tiene un 100% de probabilidad de procrear un potro con HYPP (100% N/H), cuando es apareado con un equino normal (N/N). . (Ayala, M., 2005)

De esta forma, sólo cruzando animales sanos (N/N), previamente detectados por diagnóstico molecular de Parálisis Periódica Hipercalémica, podría reducirse la incidencia de la mutación y eventualmente eliminarse (Naylor, et al. 1999, Spier, et al. 1990), a la vez que se conservan los rasgos deseables de la línea del semental Impressive. (Spier, 1993).

Sintomatología.

 

Los síntomas principales de la enfermedad en el animal son la rigidez, tremor (hiperexcitabilidad) o debilidad muscular, prolapso del tercer párpado, relincho anormal (por afección de los músculos de la laringe) y convulsiones en ocasiones acompañadas de parálisis de músculos respiratorios y cardiacos que pueden derivar en la muerte por falla cardiaca o respiratoria (Bowling et al., 1996). Estos síntomas se manifiestan principalmente en la etapa adulta de los animales afectados, pero pueden aparecer algunos de ellos  entre los dos a tres años de edad dependiendo de la influencia que tienen las prácticas de manejo como el transporte y la alimentación que estimulan dicha alteración (dado que puede ser agravada por incremento de potasio o frío). Factores como la edad, el género, y la cantidad de músculo no son importantes para la predicción de síntomas HYPP.

 

La HYPP en ocasiones es confundida con el síndrome de cólico ya que los animales afectados normalmente caen por la debilidad muscular, presentando similar incoordinación de las extremidades y los sonidos respiratorios. Pero a diferencia del cólico, la duración de una convulsión es muy rápida y el caballo está totalmente normal después de la recuperación. (ucdavis.edu, 2010)

El ataque convulsivo se produce cuando el potasio sale de la célula al torrente sanguíneo y la célula se llena de sodio produciendo una alteración en la conducción eléctrica hacia los músculos, esto surge como mecanismo compensatorio fisiológico para tratar de evitar el acumulo excesivo de cargas positivas en el interior de la célula. Los equinos son plenamente conscientes y lúcidos durante un ataque. (ucdavis.edu, 2010)

Así mismo, se han reportado manifestaciones subclínicas de animales afectados. (Citado por Moreno Chapa, J. 2007)

 

Diagnostico de la enfermedad

Una forma de llegar al diagnóstico de la enfermedad es analizando una muestra de sangre conservada en citrato sódico tomada durante uno de los ataques, para confirmar la hipercalemia, ya que en ese momento siempre se manifiesta un repentino incremento en la concentración de potasio en suero (por arriba de 8 a 9 mEq/L). Tal aumento indica que se ha alterado la entrada y salida convencional del electrolito. (Wikipedia, 2014)

El genotipo de los individuos también puede determinarse mediante una Prueba de Reacción en Cadena de  Polimerasa y Polimorfismo de Longitud en Fragmentos de Digestión (PCR-RFLP), que consiste en una amplificación in vitro de un fragmento específico del gen (Ácido DesoxirriboNucléico -ADN) del canal de sodio seguida de una separación electroforética de los productos de PCR digeridos por la enzima de restricción Taq I de los productos amplificados (Rudolph et al., 1992). De esta forma, para distinguir entre un individuo que presenta una mutación y otro que no, se elige la enzima de restricción que reconozca su sitio de corte (en un genotipo u otro), de forma que el corte se efectúe sólo en los individuos de un genotipo determinado. Posteriormente se visualizara este polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) del ADN amplificado a través de un corrimiento electroforético en gel de agarosa (Rudolph et al. 1992) mostrando en una o dos bandas los productos de PCR digeridos (Griffiths et al 1995, Puertas 1999). Esta técnica muestra una precisión de 99% (citado por Moreno, J. 2007 desde Bowling et al. 1996).

El fragmento del gen donde se da la mutación a través de la amplificación originada por la enzima termoestable Taq polimerasa, proveniente de una bacteria (Thermus aquaticus),  efectúa el proceso de polimerización de una cadena complementaria de ADN, obteniéndose millones de copias del fragmento de interés. (citado por Moreno, J.)

“La enzima de restricción Taq I lo corta si no existe la mutación, originando dos fragmentos, mientras que si la hay sólo se genera un fragmento para encontrar la mutación dentro del gen específico. Esto consiste en una amplificación de un fragmento específico del gen del canal de sodio, el cual es después digerido con una endonucleasa (enzima de restricción Taq l) que lo corta si no existe la mutación, originando dos fragmentos, mientras que si la hay solo se genera un fragmento” (Rudolph et al. 1992).

Los iniciadores a utilizar permiten la amplificación, por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, de la secuencia correspondiente al segmento del gen donde ocurre la mutación, específicamente en la base nitrogenada 2188 de su ADNc. Los iniciadores de PCR son los siguientes (Rudolph et al. 1992):

IVS2F: 5′-GGGGAGTGTGTGCTCAAGATG-3′

IVS3R: 5′-AATGGACAGGATGACAACCAC-3′

La mezcla de reacción se ejecuta mediante el empleo del estuche para PCR Taq & Go para la amplificación.

Para llevar a cabo la verificación del genotipo las bandas observadas por efecto de la digestión de los productos de PCR por la enzima de restricción, deben evidenciar los siguientes genotipos (Rudholp et al. 1992):

  • Normal (homocigoto recesivo, N/N): una banda de 64 pares de bases (pb) y una banda de 28 pb.
  • Afectado (heterocigoto, N/H): una banda de 92 pb, una de 64 pb y una de 28 p.b.
  • Afectado (homocigoto dominante, H/H): una banda de 92 pb. (Figura 6 del anexo)

Tratamiento.

Los equinos afectados pueden ser tratados con  posibilidad de reducir los signos clínicos, pero el grado que ayuda a tratamiento médico varía entre los individuos. No existe una cura.

Algunos, se ven más afectados por la enfermedad que otros y algunos ataques serán más graves que otros, incluso en el mismo individuo.

Para un atraque leve el tratamiento indicado es un poco de ejercicio, ingestión de alimentos ricos en carbohidratos o suplementados con glucosa. Se pueden necesitar diuréticos como la furosemida para detener los ataques. Acetazolamida y diuréticos de tiazida, tales como clorotiazida también son eficaces.

En cambio, el tratamiento para un ataque severo usualmente consiste en la administración intravenosa de reconstituyentes de dextrosa, calcio y sodio. El calcio intravenoso disminuye la actividad de los canales de sodio pudiendo detener los ataques. (Carlos, J., 2015)

La glucosa por vía intravenosa y la insulina estimula la captación de potasio en la célula por la Na-K ATPasa y pueden reducir la debilidad sin una pérdida de potasio corporal total.

 

Se debe considerar también, la implementación de las buenas prácticas en las explotaciones equinas tales como inocuidad de alimento de los equinos; salud e higiene del personal; calidad del agua de bebida de los equinos; programa para el control de fauna nociva; manejo de excretas y uso apropiado de medicamentos veterinarios (después de realizado el diagnóstico) siendo utilizados de acuerdo a las recomendaciones, dosis, tiempos de retiro y caducidad. (Carlos, J., 2015)

A modo de conclusión y síntesis.

En los pacientes con mutaciones en SCN4A, el canal no es capaz de inactivar, la conductancia de sodio es sostenido y el músculo permanece permanentemente tensa. Como la placa de extremo del motor es despolarizadas, más señales al contrato no tienen ningún efecto. La condición es hiperpotasemia debido a una concentración de iones de potasio extracelular alta hará que sea aún más desfavorable para el potasio a salir de la celda con el fin de repolarise que el potencial de reposo, y esto aún más prolonga la conductancia de sodio y mantiene el músculo contraído. Por lo tanto, la gravedad se reduciría si las concentraciones de iones de potasio extracelulares se mantienen bajos.

Ésta mutación no se originó como el producto de endogamia, sino que se empezó a manifestar debido a las cruzas selectivas de buscar animales con mejor musculatura (Moreno, J., 2007). Además, como la HYPP es una enfermedad de herencia dominante puede transmitirse a otras razas de caballos que utilicen Cuarto de Milla en su conformación genética.

Dada la propagación de la enfermedad en el mundo se vuelve más relevante la identificación del genotipo de los equinos para determinar así cuan intensa puede llegar a ser la afección que se presenta con mayor intensidad a los caballos homocigoto dominante (H/H) que los heterocigotos (N/H) y que solamente queda exento de padecerla aquel que posea el gen el homocigoto recesivo (N/N).

 

Anexo

Tscherig. Imagen 1.

 

Tscherig. Imagen 2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1: Fotografia del semental  Impressive (1969-1995) de raza Cuarto de Milla. Campeón y padre de caballos campeones en conformación.

 

Tscherig. Imagen 3

 

Figura 2: Extraída del artículo Parálisis periódica hipercaliémica: presentación de una familia española con la mutación p.Thr704Met en el gen SCN4A en el cual se muestra el ideograma del cromosoma y un esquema del gen que se presenta de manera similar en los equinos.

 

 

 

Tscherig. Imagen 4

Figura 3: Ejemplo de interpretación de resultados del tratamiento de los productos de PCR con la enzima de restricción Taq I. Se muestra los genotipos homocigoto dominante (normal, NN) en el carril 1, heterocigoto (portador, NH) en el carril 2 y homocigoto recesivo (afectado, HH) en el carril 3. Se utilizó el marcador de peso molecular Hiperladder V para verificar el tamaño de los productos de PCR (Moreno Chapa, J. 2007).

Tscherig. Imagen 5

 

Figura 4. Ejemplo de visualización en el fotodocumentador  Fluor- S Multimager*1 (Bio- Rad) de la purificación de ADN a partir de muestras sanguíneas. Carriles 1 y 10: Marcador de peso molecular; carriles 2 a 8: productos de PCR; Carril 9: control negativo. Puede verse que todas las muestras, excepto la del carril 3,(quizá debido a errores de preparación de la mezcla de reacción para PCR siendo ideal que se repitiera el proceso de amplificación)  mostraron el producto de PCR esperado de 92 p. b. (Moreno Chapa, J . 2007)

 

Tscherig.Imagen 6

 

Figura 5: Ejemplo de visualización de análisis RFLP. Puede verse que la Muestra 1 tiene las bandas de 92 y 64 pb., mientras que la muestra 2 solo tiene la banda de 64 pb. La banda de la muestra 3 es un dímero de iniciador. (Moreno Chapa, J., 2007)

Bibliografía

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– Ayala,-Valldovinos, MA.; Anguiano-Estrella R.; Galindo-García, J.; Sánchez-Chiprés DR.; Duifhuis-Rivera, T. (2002). Prevalencia del gen de la parálisis periódica hipercalémica (hypp) equina y del gen del síndrome overo letal blanco (olws) en caballos importados a México. De http://comvepebc.com/wp-content/uploads/2015/07/Prevalencia-de-los-genes-HYPP-y-OLWS-en-Caballos-Importados-a-M-%C2%AExico.pdf/

                                                         

– Ayala-Valdovinos MA, Villagómez, DAF, Galindo-García J, y Sánchez-Chiprés DR. Diagnóstico molecular (PCR-RFL) de parálisis periódica hipercaliémica equina. XXV Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Médicos Veterinarios Especialistas en Equinos, A. C. Octubre 8-11 de 2003:141–144. México.

 

-Carlos, J. (2015). Alcances del Diagnóstico Veterinario: El uso de técnicas moleculares. Lavet. Retrieved 16 November 2015, de

Alcances del Diagnóstico Veterinario: El uso de técnicas moleculares

 

– Barrett, K., (2010). Ganong Fisiología Médica. Edición 23a. México, D.F.Editorial Mcgraw-Hill. Sección II. pp: 93-114.

 

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– Narberhaus, B; Cormand, B.; Cuenca-León, E; Ribasés, M; Monells J. (2008) Parálisis periódica hipercaliémica: presentación de una familia española con la mutación p.Thr704Met en el gen SCN4A. Neurología. 23(7):427-435

-Naylor, J; Niquel, DD; Trimiño, G.; Lightfoot K; Adams, G. (1999) Hyperkalaemic periodic paralysis in homozygous and heterozygous horses: a co-dominant genetic condition en Equine Veterinary. Volumen 31, número 2, Marzo 1999. pp 153-159.

 

-Pirila R, Lehmus S, Somer H, Baumann P. (2002) Hyperkalemic periodic paralysis. Duodecim.118(14):1475-9.5.

 

-Rudolph, J; Spier, S; Byrns, G; Rojas, C; Bernoco, D y Hoffman. (1992). Parálisis Periódica en Caballos Cuarto de milla: una mutación en el canal de sodio difundida por la crianza selectiva. Nature Genetics. 2, 144-147.

 

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http://www.aqha.com//

http://www.horsetesting.com/Equine/Genetic_Disease/HYPP.asp (Hyperkalemic Periodic Paralysis Disease)

 

 

Enfermedad renal poliquistica, conocida con las siglas PKD (Polycystic Kidney Disease)

images (1)Nuevamente quiero dejarles una monografía realizada por uno de mis alumnos, en este caso Rocío Vega sobre Enfermedad poliquística renal en felinos. Felicitaciones por el trabajo y espero ayude a muchos otros que buscan infromación sobre el tema

 

ENFERMEDAD POLIQUITISCA

RENAL EN FELINOS

Alumno/a: Vega I. Rocío.

Año: 3°.

Curso: GenéticaBásica.

Profesor/a: Gabriela M. Iglesias.

Universidad: Universidad Nacional de Rio Negro. Sede Valle Medio.

 

INTRODUCCION

En la siguiente monografía se tratara la enfermedad renal poliquistica, conocida con las siglas PKD (Polycystic Kidney Disease) también llamado enfermedad poliquistica renal felina, autosómica dominante, que es la enfermedad genética hereditaria más frecuente en gatos persas, exótico cruzas de esta raza. Afecta principalmente los riñones del gato y aqueja al 37% de la población felina mundial. Consiste en la aparición de pequeños quistes en la corteza renal, que aumentan de tamaño con la edad a medida que se rellena de orina provocando la aparición de insuficiencia renal irreversible, aparece asimismo en el hígado y páncreas ocasionalmente.Actualmente, la PKD  se considera una importante causa de insuficiencia renal que podría afectar a la tercera parte de la población mundial de gatos lo que hace que esta enfermedad sea unas de las de mayor prevalencia dentro de las dolencias hereditarias de los felinos (Ferreira; 2010)

 

 

DESARROLLO

Las primeras referencias de la presencia de esta enfermedad en el gato son de hace 30 años pero los estudios específicos no se empezaron a desarrollar hasta 1990. Actualmente se sabe que es una enfermedad hereditaria y codificada por un gen autosómico dominante. Esto quiere decir que se transmite de padres a hijos a través de los cromosomas no sexuales, no es una enfermedad ligada al sexo (Ya-Jane Lee; 2010).

 

La ERP se caracteriza por la presencia de quistes de tamaño variable que pueden estar ubicados en la corteza o en la médula renal y ocasionalmente en otros órganos como el hígado, páncreas y bazo. Presenta un carácter hereditario autosómico dominante y por ello no existe predisposición ligada al sexo. Aunque en el gato los quistes pueden aparecer en animales jóvenes, las manifestaciones clínicas de la enfermedad no aparecen generalmente antes de la edad adulta (Ferreira; 2010).

Es una enfermedad hereditaria de tipo autosómico dominante causada por una mutación puntual del gen PKD1, situado en el cromosoma 18 exón 29 (E3), donde una adenina es sustituida por una citosina en la posición 3284, generándose de esta manera un codón de stop que como consecuencia resulta en la pérdida del 25 % de la proteína C-terminal y que da la formación de una proteína anómala, la policistina, que será la responsable directa de la formación de quistes.

 

 

El carácter hereditario autosómico dominante está relacionado con dos tipos de genes. El gen P que representa la forma dominante y el gen p que representa la forma recesiva. Cada individuo posee dos genes en el locus para ERP: un materno y un paterno. De esta forma, los genes pueden proveer tres combinaciones que son: PP como forma genotípica de homocigoto positivo y fenotípico positiva (el animal padece la enfermedad), Pp como forma genotípica de heterocigotos positivos y fenotípica positiva (el animal presenta la enfermedad), y pp como forma genotípica de homocigotos negativo y fenotípica negativa (el animal no padece la enfermedad). Los animales homocigotos dominantes (PP) queposeen un gen ERP proveniente del padre y otro de la madre no sobreviven, estos animales poseen una forma grave y letal de la enfermedad con muerte antes del nacimiento a una edad temprana, es decir los gatos homocigotas dominantes (PP) mueren en el útero materno. Los padres genéticamente recesivos y negativos (pp) para ERP no pueden producir en su descendencia gatos positivos, a menos que haya una mutación genética. Por tanto, todos los gatos afectados son heterocigotos (Pp), van a desarrollan la enfermedad entre los 5- 7 años.

De esta manera el cruzamiento de dos gatos negativos, homocigotos recesivos (pp), resulta en gatos sanos. El cruzamiento de un gato sano (homocigoto recesivo) con un gato afectado (heterocigotoPp) tiene una probabilidad del 50% de que los gatos sean sanos y la otra mitad sean gatos afectados. El cruzamiento de dos gatos con ERP (heterocigotoPp) puede provocar estadísticamente un 75% de gatos afectados con la enfermedad y el 25% de gatos sanos. Entre los gatos afectados, un tercio serán homocigoto-dominantes (Ferreira; 2010).

 

Gato libre: pp Gato heterocigótico: Pp Gato homocigótico: PP

Gato heterocigota Pp X  gato libre pp.

50 % de probabilidad de enfermos.

Gato homocigota PP x gato libre pp.

100 % de enfermos.

Gato heterocigota Pp x gato heterocigota Pp.

75% de probabilidad de enfermos.

Gato homocigota PP x gato homocigota PP.
100% de enfermos.Letal

Gato libre pp x gato libre pp.

100% de libres.

 

Los gatos con ERP son frecuentemente asintomáticos cuando la afección es unilateral y demuestran signos de insuficiencia renal cuando es bilateral.En todo caso, los signos clínicos son variables y se asocian al crecimiento de los quistes y a la presión sobre el parénquima renal periférico al quiste que causa daño progresivo de nefronas. Al ser una enfermedad hereditaria, los quistes están presentes desde el nacimiento del gato, al principio el tamaño del quiste es de menos de 1 milímetro. A medida que el animal se desarrolla y va cumpliendo años, los quistes empiezan a crecer hasta alcanzar varios centímetros hasta 2 centímetros.Los signos suelen aparecer entre los tres y los diez años de edad. Se puede observar letargia, anorexia, vómitos, polidipsia, poliuria, pérdida de peso, hematuria, mucosas pálidas, relacionados con la gravedad de la insuficiencia renal crónica. La hematuria en gatos es probablemente el resultado de hemorragias intra-renales y es similar al que sucede en humanos. A la palpación los riñones estarán alargados e irregulares. (Ferreira; 2010).

Diagnostico

Entre las herramientas para el diagnóstico de la ERP en los gatos se incluyen la anamnesis, el examen clínico, los análisis de sangre y orina, las pruebas genéticas, la ultrasonografía renal, la tomografía computarizada, la urografía excretora y el estudio histológico de biopsias renales. La biopsia renal está contraindicada en presencia de quistes grandes.

 

Pruebas genéticas

Es posible identificar la mutación asociada a la ERP mediante la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinado con un estudio del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).Estos métodos necesitan de una gran cantidad de ADN y de buena calidad. El presente estudio para la identificación del PKD1 se puede desarrollar en una veterinaria que disponga del equipo necesario fácilmente. (Ferreira; 2010).

Para el genotipeo del exón 29 del gen PKD1 por ARMS (amplification refractory mutant system) PCR, se designan dos set de primers para rotular ya sea el alelo mutante o el normal, basado en el punto de mutación de Citosina- Adenina.

La amplificación de los dos alelos (alelo-especifico)  toma lugar en direcciones opuestas y los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden ser fácilmente visualizados en gel agarosa por electroforesis (fig n°2). La discriminación de la amplificación depende principalmente de la falta de coincidencia de nucleótidos en el primer 3´-terminacion. El priming alelo- especifico del proceso del PCR solo permitirá que la amplificación se pueda hacer cuando el 3´- nucleótido terminal concuerde con su secuencia diana. Además se agregó deliberadamente un desajuste adicional en la cuarta parte del último nucleótido, en la posición final del 3´primer para incrementar el rango de discriminación(Fig n°1).  (Ya-Jane Lee; 2010).

Procedimiento de Prueba

Como se muestra en la figura 2  el primer específicos del alelo mutante F3 y R2 amplificó un fragmento de 277 pb sólo de la muestra mutante, mientras que el fragmento de ADN con un tamaño esperado de 189 pb fue amplificado a partir del alelo de tipo salvaje por los cebadores F2 y R3. Como era de esperar, el producto de PCR correspondiente a el alelo normal también se obtuvo de la muestra de ADN que contenía el punto mutante PKD1 porque los gatos con PQRAD son heterocigóticos en el locus de este gen. Estos resultados confirmaron la especificidad de estos set de primers para diferenciar el alelo PKD1 normal del alelo PKD1 mutante que contenía un solo punto de mutación.

A continuación, para simplificar el procedimiento de manejo, para posibilitar  la amplificación simultánea del alelo mutante y normal los productos específicos en 1 tubo se puso a prueba. Cuatro primers: 1 ml de F2, F3, R2, y R3 (10 mM) se incluyeron en 1 reacción (ARMS-tetra primers de PCR) para investigar si porciones de los dos alelos diferentes de PKD1 podrían ser diferencialmente amplificada. Tres productos que representan la amplificación del alelo mutante (227 pb), de la normal alelo (189 pb), y un control interno (429 pb) se esperó que fuesen amplificados en los experimentos (Fig 1b). Como se muestra en la figura 2 barra 5 solo dos productos de PCR de429 pb y 277 pb fueron amplificados por el set de primers externos F2 / R2 y el primer par-alelo mutante F3 / R2. La ausencia del producto 189-bp indicó que el primer normal alelo fallo al ser amplificado. Se hicieron intentos para optimizar la ARMS tetra-primer reacción de PCR, por ejemplo, el ajuste de la temperatura de recocido (68-72°C) y usando diversas concentraciones de primers individuales y de MgCl2(1-5 mM); sin embargo, no se obtuvieron resultados satisfactorios. En consecuencia, un ARMS tri-PCR primers fue desarrollado para superar el problema como se describe a continuación. Según lo informado por otros grupos de investigación, los gatos que se ponen a prueba y dan positivo para el alelo mutante son heterocigotos y, por lo tanto, también tienen un alelo de tipo salvaje. Debido a que tanto gatos normales como afectados PQRAD contienen alelo normal, la detección de la presencia de 1 alelo normal no es crítico para diagnóstico de la PQRAD, siempre y cuando el control interno que rotula otra región del gen de PKD se amplifique con éxito para asegurar que el PCR era funcional. Esto condujo a el desarrollo de una prueba de ARMS PCR que utiliza sólo 3 cebadores (ARMS-triprimers de PCR) y que omite el primer alelo normal- R3 (Fig. 1C). (Ya-Jane Lee; 2010)

PCR polquistica renal

 

Fig n° 1. (Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010)

 

 

PCR 1 Vega

PCR 2

Fig n° 2. (Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010)

 

Se señaló que la prueba genética de PCR-RFLP fue más sensible que la ultrasonografía para detectar la ERP en gatos persas de menos de tres meses de edad.

Los gatos persas y afines a gatos persas deben ser probados para ADPKD (autosomal dominant polycystic kidney disease) antes de la cruza. Incluso cuando los criadores de gatos saben que nunca deben cruzarse animales que posean el gen mutante PKD1, esto sigue ocurriendo por varias razones:

·         Los animales portadores no expresan signos clínicos de ADPKD en la vida temprana.

·         Muchos criadores todavía no son conscientes de la enfermedad y su impacto.

·         La ecografía no está disponible o su costo es muy elevado.

·         La cruza se realiza previo a un diagnóstico preciso.

·         La enfermedad tiene una alta prevalencia, por lo tanto, muchos criaderos podrían perder aproximadamente el 40 % de su población reproductora.

Las pruebas genéticas para ADPKD proporcionan un método preciso y eficiente de la selección de los gatos de cría, y así podría funcionar para eliminar ADPKD del programa de cría (Marcela C. Scalon; 2014).

 

Tratamiento

 

Las opciones de tratamiento están muy limitadas y son de muy mal pronóstico, se debe tratar como un riñón terminal y esto incluye rehidratación y estabilización del paciente, restricción en la dieta de proteínas para evitar la alta producción de metabolitos nitrogenados, disminuir los niveles de urea en el organismo, restricción de fósforo en la alimentación, y suplementación dietética en cuanto sea posible con vitaminas, taurina, potasio, sodio, bicarbonato. Es recomendable proveer al paciente de agua fresca ad libitum. Se debe evitar en lo posible el estrés a estos gatos. El trasplante renal es una opción si se dispone de donante y de la infraestructura necesaria para hacerlo aunque, por regla general, no está a nuestro alcance para gatos con insuficiencia renal crónica por enfermedad renal poliquística (Lorena Millán Varela;).

 

 

CONCLUSION

 

A modo de conclusión se puede decir que esta enfermedad de carácter dominante autosómico que afecta principalmente a los gatos persas y a los felinos producto de la cruza con esta raza, es uno de los mayores problemas para los criadores y propietarios debido al carácter crónico de la enfermedad. Afecta principalmente la funcionalidad del riñón, pero también puede llegar a afectar el páncreas e hígado apareciendo en animales de edad avanzada pero que está presente en el felino desde el momento de su nacimiento. La detección de la enfermedad es simple siendo la ecografía, o exámenes genéticos como el PCR los más comunes y usados. En caso de que el animal de positivo a la enfermedad poliquistica renal se deberá proceder a la esterilización de este y realizar el tratamiento adecuado para garantizarle una buena calidad de vida dentro de las posibilidades de este.

 

BIBLIOGRAFIA

 

·         Ferreira, G.S; Anales de veterinaria de Murcia; 2010. Enfermedad renal poliquística en gatos: Revisión de la literatura. Vol 26. (http://hdl.handle.net/10201/20623).

·         Ya-Jane Lee; Journey of Veterinary Diagnostic Investigation; 2010. Molecular Detection of Autosomal-Dominant Feline Polycystic Kidney Disease by Multiplex Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction(http://www.researchgate.net/publication/44583283).

·         Lorena Millán Varela; Facultad de Veterinaria. Universidad de León;Importancia de la Enfermedad Renal Poliquística en el gato Persa. (http://eurhydice.kormak.es/Enfermedades.pdf).

·         Marcela C. Scalon ; Journal of veterinary diagnostic investigation; 2014; Touchdown polymerase chain reaction detection of polycystic kidney disease and laboratory findings in different cat population; (http://vdi.sagepub.com/content/26/4/542).

 

¿Como se ve el ADN?

Crédito: Gabriela Iglesias

Crédito: Gabriela Iglesias

Esta pregunta me la hace muy a menudo mis alumnos porque cuando uno realiza una extracción de ADN, el ADN es viscoso pero transparente, entonces como se ve luego en un gel de agarosa si es transparente, tanto el gel como el ADN.

Hasta hace unos años atrás, se usaba el loading buffer con Azul de metileno paa indicar por dónde estaba migrando el ADN por el gel pero para poder realmente ver el ADN se suaba el Bromuro de etidio que es un colorante que bajo luz UV se pude visualizar y como se intercala entre las bases de ADN nos muestra el ADN. Se usa un aparato llamado transiluminador UV

Hoy leyendo un artículo de Vicky Doronina en BitesizeBio.com me encontré con una interesante historia que relata el comienzo y el fin de la era del bromuro de etidio. Como el artículo está en inglés, les quería dejar la traducción

Durante varias décadas, bromuro de etidio (EtBr) era la tinción característica del biólogo molecular para la visulaización de ADN. Ahora, debido a la paranoia colectiva sobre sus supuestos efectos cancerígenos, EtBr se está consignado a los libros de historia, junto con los gradientes de cloruro de cesio (CsCl) , la clonación en fago lambda, y la secuencia de ADN en el laboratorio. Es hora de tener una mirada histórica a donde todo comenzó.

Un comienzo lento

En la década de 1960 el ADN viral, el de los plásmidos y el ADN mitocondrial se separó del ADN genómico de peso molecular mucho más alto por centrifugación de alta velocidad en gradientes de CsCl, una versión muy simplificada de la misma proceso todavía se utiliza durante las preparaciones de ADN de (minipreps) plásmidos: piezas de ADN cromosómico junto con restos celulares separado de  las moléculas de plásmidos más ligeros, compactadas por centrifugación.

A diferencia de los 15 min a 12.000 xg  utilizados para minipreparaciones modernas, la separación en CsCl a cientos de miles de xg tomó días. En 1966 H. Thorne publicó dos artículos (1, 2), en el que mostró una posibilidad de separar el ADN del virus del polioma a partir del ADN de la célula huésped usando electroforesis en gel de ADN radiomarcado.

Seis años después de los artículos de Thorne, investigadores holandeses en ADN mitocondrial (C. Aat y P. Borst)  entran en la historia. Al igual que con muchos avances científicos, era como el resultado de que algo salga mal, lo que les llevó a su descubrimiento- en su caso, la ruptura de la ultracentrífuga.

Conocer la existencia de documentos de Thorne, los investigadores decidieron ver si podían separar el ADN mitocondrial en un gel. Se utilizaban de forma rutinaria en los gradientes de EtBr para separar diferentes formas de ADN mitocondrial (superenrollado, circular y lineal), era lógico para usarlo en los geles también. Además, los autores dicen que “siempre admiraban las bandas de color naranja brillante en los gradientes”, por lo que el placer estético jugó un papel en el desarrollo de la ciencia.

A partir de los primeros en adoptarlo a la actualidad

Pero el resto no es historia. Aunque la separación de ADN mitocondrial en un gel usando EtBr ha resultado tan exitoso que Aat y Borst Nunca volvieron a reparar la centrífuga, no siguieron trabajo (1.972 3) con más estudios en esta área (4).

Una revisión histórica actual por un ganador del Premio Nobel de la R. Roberts(5) cita otro artículo escrito por Sharp et al (1973) (6) donde se explicaba como usar una tinción de EtBr durante la separación del ADN por electroforesis de ADN. Aunque de Sharp et al utiliza la misma lógica de comenzar con tinción EtBr en gradiente, seguido de tinción de geles después de la corrida electroforètica y / o la adición de EtBr a los geles como Aat y Borst, que no citan el documento anterior. Formalmente, Aat y Borst tienen una prioridad porque publicaron el método primero, pero de el artículo de Sharp et al se cita 3 veces más frecuentemente, probablemente debido a su incorporación a la utilización de otra tecnología de vanguardia 1970 – digestión del ADN con enzimas de restricción.

¿Donde esta ahora?

Ahora, a principios del 21 st siglo EtBr está siendo ampliamente utilizado en muchos laboratorios aún, pero la combinación de su supuesto efecto cancerígeno y su exigencia de luz UV ha causado una fuerte presión en la salud y seguridad, para reemplazarlo en muchas instituciones. Muchos laboratorios fueron “EtBr libre” y probablemente no hay vuelta atrás. Varios tintes o tinciones alternativas están actualmente en uso como sustituto de EtBr, usted puede leer sobre ellos en este artículo.

La historia del ascenso y caída de EtBr muestra un patrón visto a menudo con técnicas científicas: saltos intuitivos basados ​​en ideas previas, a menudo olvidados; un comienzo lento seguido por la adopción generalizada. Por último, el descenso en una controversia de quién lo usó por primera vez.

Literatura:

Literature:

  1. Thorne H. V. Electrophoretic separation of polyoma virusDNA from host cell DNA. Virology (1966), 29, 234 – 239.
  2. Thorne H. V. Electrophoretic characterization and fractionation of polyoma virus DNA. J. Mol. Biol. (1967), 24, 203 – 211.
  3. Aat C. and Borst P. The gel electrophoresis of DNA.Biochim. Biophys. Acta(1972), 269, 192 – 200.
  4. C. Aat and P. Borst. Ethidium DNA Agarose Gel Electrophoresis: How it Started. IUBMB Life, 2005, 57(11): 745 – 747
  5. Roberts R.J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.PNAS (2005), 102(17), 5905 – 5908
  6. Sharp P. et al. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose–ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry (1973), 12(16), 3055-63.

Espero les hasya gustado como a mí.

Si prefieren leer el artículo orginal en inglés, les dejo el link abajo

Fuente: http://bitesizebio.com/25292/burning-bright-a-brief-history-of-ethidium-bromide-dna-staining/?utm_content=24584782&utm_medium=social&utm_source=facebook

Técnica de CrispCas9 para editar el genoma

 

 

Fuente: Crips Casp9 de synbiomx.org

Fuente: Crips Casp9 de synbiomx.org

La técnica de Crisp Cas9 descubierta solo hace un par de años ha revolucionado la ingeniería genética y la posibilidad de crear animales transgénicos, así como crear mutaciones en animales de laboratorio que sean modelos para estudio de enfermedades hereditarias, tanto las producidas por mutaciones simples, como las que se originan por varias mutaciones en disitnos genes, en diferentes cromosomas o sitios del genoma. Por ende podría ser utilizada para terapia génica en humanos que padecen enfermedades hereditarias.

Sin más introducción les quiero dejar un video que he traducido al castellano (español) sobre la técnica. Espero les guste.

Saludos

Gaby

Glosario de Genética: para principiantes

Glosario Hablado de Términos Genético

Glosario Hablado de Términos Genético

Hola a todos, si alguna vez leyendo alguna de estas paginas, u otros Blogs, les ocurre que se encuentran con términos que no conoces o no saben que significan, les recomiendo este sitio del  National Human Genome Research Institute and National Institutes of Health  que contiene además ilustraciones, pronunciación de cada tema y hasta incluye un test online para evaluar tus conocimientos. La verdad es que está muy bien hecho.

Les dejo el link y espero les sirva

Saludos

http://www.genome.gov/GlossaryS/

PCR en tiempo real – Medicina molecular

En la página de Medicina molecular les dejo una breve introduccción a la PCR cuantitaiva en tiempo ela y algunas de sus aplicaciones. Espero que les sirva

Saludos

PCR en tiempo real – Medicina molecular.

Gel Electrophoresis Animación para práctica de laboratorio

La página del “Genetic Science Learning Center” de la Univerisdad de Utah, hace tiempo que posee una serie de herramientas educativas muy interesantes para nuestros alumnos.

Se animan a separar fragmentos de ADN de distitnos tamaños? Esto se hace usando la separación en geles de agarosa mediante el uso de una fuente de poder eléctrica. Por eso se denomina electroforesis.

Se animan a tomar las muestras y poneras en el gel? con este tipo de animación pueden hacerlo.

El único problema es que está en inglés, pero como práctica y para repasar los conceptos me parece muy lindo

Les dejo el link abajo

A disfrutarlo!!!

Gel Electrophoresis.

Eliminan VIH del genoma humano – Investigación y Desarrollo

Que buena noticia!!!

 

Eliminan VIH del genoma humano – Investigación y Desarrollo.

Bioarray: Diagnóstico Genético

Bioarray es un laboratorio de diagnóstico e investigación especializado en el análisis genético y dirigido al sector médico, de investigación y biotecnológico

¿De que hablamos ahora?

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