Monografías de Alumnos: CRISP

Su aplicación en Mosquitos causantes de la Malaria

Palabras Clave: Malaria, Mosquito Transgénico, CRISPR-Cas9, Deriva Génica. 

Resumen: En el presente escrito se evalúan, dentro de un marco teórico, cómo se podrían modificar genéticamente los mosquitos portadores del agente causal de la malaria, un protozoario del género Plasmodium, utilizando el método de CRISPR-Cas9 sobre los insectos dentro del laboratorio, su posterior liberación en el medio ambiente, y su efectividad e impacto como posible vía para generar una deriva génica dentro de la población de mosquitos salvajes, considerando además los actuales métodos de control de la malaria, tanto los de origen genéticos como  los convencionales.

La malaria, también conocida como Paludismo, en el ser humano, es una enfermedad parasitaria causada por la infección de una o más de las especies del parásito protozoario intracelular Plasmodium ya sean Plasmodium falciparum, ovale, vivax y/o malariae (Heymann ,2011). Es una enfermedad mortal que es causada por dicho Plasmodium y transmitida por la picadura de mosquitos hembra del género Anopheles, los llamados vectores del paludismo.

Según la OMS: P. falciparum es el parásito causante del paludismo más prevalente en el continente africano. Es responsable de la mayoría de las muertes provocadas por el paludismo en todo el mundo. En cambio, P. vivax es el parásito causante del paludismo dominante en la mayoría de los países fuera del África subsahariana.

Se calcula que en 2016 hubo 216 millones de casos de paludismo en 91 países, las muertes fueron de 445 mil personas, lo que es una cifra demasiado alta ya que se trata de una enfermedad prevenible y tratable de manera relativamente fácil, sin embargo, muchas de las áreas afectadas son de recursos extremadamente precarios y bajo constante conflicto civil y militar, lo cual dificulta mucho no solo el alcance de ayuda exterior sino cualquier tipo de intervención interna.

La prevención de esta enfermedad se basa fuertemente en la lucha antivectorial para reducir la transmisión del paludismo. Según la organización mundial de la salud en 2018: “Para el control efectivo del vector, recomienda proteger a toda la población que se encuentra en riesgo de infectarse. Hay dos métodos de lucha contra los vectores que son eficaces en circunstancias muy diversas: los mosquiteros tratados con insecticidas y la fumigación de interiores con insecticidas de acción residual.”

Entre 2015-2017 se realizó la distribución de 624 millones MTI o mosquiteros tratados con insecticida, (principalmente de larga duración), un aumento sustancial con respecto a los 465 millones del 2012-2014. De todos estos, el 82% o 459 millones, fue entregado en la región de áfrica subsahariana. (OMS, 2018)

La malaria es endémica en más de 100 países, especialmente en América Central y del Sur, República Dominicana, Haití, África, Asia (India, Sureste asiático y Oriente Medio) y Pacífico Sur.

Palabras Clave: Malaria, Mosquito Transgénico, CRISPR-Cas9, Deriva Génica.

En el presente escrito se evalúan, dentro de un marco teórico, cómo se podrían modificar genéticamente los mosquitos portadores del agente causal de la malaria, un protozoario del género Plasmodium, utilizando el método de CRISPR-Cas9 sobre los insectos dentro del laboratorio, su posterior liberación en el medio ambiente, y su efectividad e impacto como posible vía para generar una deriva génica dentro de la población de mosquitos salvajes, considerando además los actuales métodos de control de la malaria, tanto los de origen genéticos como los convencionales.

 Figura 1. Distribución mundial de la malaria. Fuente: OMS, 2010

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En el 2017 los países endémicos de Malaria invirtieron 3,1 mil millones de dólares para el control y eliminación de la enfermedad, 2,2 mil millones se gastaron en la región de África seguida por 300 millones en el sudeste asiático, en las Américas 200 millones y el este  Mediterráneo y Pacífico Occidental 100 millones cada uno, a pesar de esta cantidad de inversión no se llega a alcanzar las metas de la ETM (Estrategia Técnica mundial contra la Malaria), esta tiene como objetivo una reducción del 40 por ciento de incidencia en casos de malaria a nivel mundial. Para alcanzar las metas de la ETM a 2030 se estima que la financiación anual para la malaria tendrá que aumentar en al menos 6,6 mil millones por año

hasta el 2020.

“El conocimiento del ciclo de vida de este parásito indica que el estadio más vulnerable del Plasmodium es el ooquiste encontrado en el intestino medio (de sólo cinco ooquistes por insecto), razón que lo convierte en el primer blanco de ataque empleando mosquitos

transgénicos que expresen moléculas efectoras antiespasmódicas”.(Noguez Moreno, et al 2017)

A lo largo de los años los avances en la ciencia y tecnología genética gracias a quienes la desempeñan, ya sean investigadores, científicos o genetistas nos ayudan a comprender y hasta poder solucionar mediante el uso de ingeniería genética problemas relacionados a la salud humana y animal.

Los métodos de biología molecular y de las ciencias genómicas generan conocimientos más precisos de la fusión y expresión genética, lo que es fundamental para el entendimiento de la fisiología molecular de insectos y en la generación de MTs (mosquitos transgénicos) para el control de insectos y las ETV (enfermedades transmitidas por vectores).(Noguez Moreno, et al., 2017)

Históricamente dentro de las estrategias utilizadas para el control de enfermedades vectoriales con respecto a la manipulación genética, nos podemos encontrar con una amplia variedad de enfoques y diferentes acercamientos a la problemática. Segun Noguez Moreno,  et al., 2017  estos pueden dividirse en un Control “Clásico” y el uso de Mosquitos Transgénicos o MTs; Así, el primero se enfoca en generar insectos estériles o bien con reproductibilidad reducida por medio de productos químicos o radiación sobre los huevos y luego que estos sean liberados al medio ambiente natural. Si bien este método fue el más utilizado después de la segunda guerra mundial por más de 4 décadas, debido al coste de mantenimiento del equipo, de la mano de obra y de la liberación de los insectos, prácticamente ha quedado en desuso.(Noguez Moreno et al., 2017)

Figura 2: Fuente: Noguez Moreno et al.,2017

El uso de MTs por otro lado cobra impulso con cada nuevo avance en el área de la genética; Pueden encontrarse así los Mosquitos Refractarios, es decir, que expresan una cualidad que los hace inmunes a la infección del agente en si, los Mosquitos Transmisores de Genes Letales de Uno o Dos Componentes, que básicamente consiste en introducir un gen que se comporta como letal (produce la muerte del portador) cuando se encuentra en heterocigosis, los Mosquitos con Fenotipo sin Vuelo, donde se les genera una modificación en su capacidad para volar y son eliminados naturalmente por depredadores o bien no pueden alimentarse ni volar, y por último, pero no menos importante la Deriva Génica o Genéticamente Dirigido (GD por Gene Drive en inglés), donde se fuerza la imposición de la presencia de un alelo sobre otro dentro de una población generando por ende la desaparición de este último.(Noguez Moreno, et al., 2017)

Naturalmente la deriva génica es una fuerza evolutiva que ocurre como un cambio en las frecuencias genéticas debido a un resultado de eventos aleatorios de una generación a la otra, puede ser muy efectiva y marcada en poblaciones pequeñas, además podría resultar en la fijación de un alelo, es decir, que este termine siendo el único presente en la población.

Figura 3. El concepto de genética dirigida (del inglés Gene Drive: GD) lo podemos ejemplificar en un caso hipotético de un transgen que bloquea la transmisión de la malaria (pero que no tiene valor selectivo en la población de insectos). Se podría impulsar el incremento en su frecuencia genética en la población, sustituyendo a los silvestres (sin color) a través de una construcción genética que incluya un gen que proporciona una ventaja selectiva (Gene Drive o GD) (en rojo). Genética dirigida es lo mismo que decir deriva génica.  Fuente: Noguez Moreno, et al., 2017

De manera artificial con el fin de modificar poblaciones; la deriva génica se puede usar  tanto como para que una nueva población de Mosquitos Refractarios reemplace a otra vieja o para la supresión gradual de una especie al generar deriva génica sexual. Los métodos más comunes son los Elementos Medea, (elementos alélicos “egoístas” que se imponen sobre su contraparte al generar la muerte de la cría que carece del elemento), el uso de las Bacterias del Género Wolbachia, (el cual se comporta también como elemento génico egoísta y de carácter simbiótico que puede transmitirse por vía materna) y la aplicación de CRISPR-Cas9, tanto sobre un gen como también sobre la frecuencia sexual dentro de una población.

Figura 4. Fuente: Noguez Moreno, et al., 2017.

La manipulación de la frecuencia de un gen con CRISPR-Cas9 consiste básicamente en introducir dentro de un gen esencial un segmento exógeno con la información que dotaría de inmunidad al individuo contra el agente, así cualquier intento de eliminar esta seccion por parte del sistema natural de reparación del ADN resultaría en la muerte del individuo en lugar de generar una especie de “resistencia”, y si a esto se le suman más segmentos exógenos el proceso de resistencia se vuelve indetectable poblacionalmente.

La manipulación de la frecuencia de un sexo usando CRISPR-Cas9 es una de las estrategias más nuevas, recién introducida en 2016, y consiste en que Cas9 ataque un gen alosómico que reside en uno de los cromosomas sexuales con una incidencia en el nacimiento de machos de casi un 90%, y debido a que estos no son hematofagos, cualquier transmisión de vía salivaria quedaria incapacitada,  además esto facilita la deriva génica ya que solo los machos la producen y no las hembras.

Figura 5.Genética dirigida (GD) utilizando el sistema CAS9-ARN guía. Las ventajas incrementan introduciendo varias unidades de ARN guía, lo que aumenta la frecuencia de corte y dificulta la evolución de alelos resistentes a GD a niveles indetectables. Al elegir sitios diana dentro de un gen esencial, debe ser modificados para hacer un alelo resistente e incluirlo en la construcción para unirlos a la construcción genética que lleva el sistema CAS9-ARN guía, y tanto al gen marcador, como al gen refractario (por ejemplo). Cualquier acontecimiento que elimine los sitios blanco del sistema CAS9-ARN, producirán letalidad en lugar de crear una unidad de alelo resistente, lo que aumenta aún más la robustez de la construcción genética GD y favoreciendo la sustitución poblacional de insectos. Fuente: Noguez Moreno, et al., 2017

La tecnología CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para “editar” o “corregir” el genoma de cualquier célula. Sería algo así como unas tijeras moleculares que son capaces de cortar cualquier molécula de ADN haciéndolo de una manera muy precisa y controlada. La capacidad de cortar el ADN es lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN, se basa en un sistema natural de defensa bacteriano contra los virus bacteriofagos. Estos virus infectan bacterias al inyectarle su material genético, luego este se aprovecha de la maquinaria interna para fabricar otras réplicas de sí mismo, generalmente mata a la bacteria en el proceso. Si la bacteria sobrevive puede utilizar fragmentos del ADN vírico para incluirlo dentro de su propio material genético y así contar con una “copia de seguridad” que permite identificar rápidamente una posterior invasión de ese mismo material. (Ann Ran, et al., 2013)

Figura 6. Ilustración de cómo ingresa originalmente el material genico viral dentro de la bacteria, y los pasos subsecuentes para registrarlo y utilizarlo como propio dentro del sistema defensivo CRISPR. Fuente:Gantz, 2015.

El ADN tomado del virus son segmentos de bases repetidas múltiples veces y a su vez estos fragmentos también se repiten dentro del propio ADN, no suelen ser muy largos y están condensados, por esto se llaman repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas o Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats o CRISPR en inglés. (Ann Ran et al, 2013)

“Cuando un virus entra dentro de la bacteria toma el control de la maquinaria celular y para eso interacciona con distintos componentes celulares. Las bacterias que tienen este sistema de defensa tienen un complejo formado por una proteína Cas unida al ARN producido a partir de las secuencias CRISPR. Entonces el material génico del virus puede interaccionar con este complejo, al ocurrir esto el material genético viral es inactivado y posteriormente degradado. Pero este sistema va más allá. Las proteínas Cas son capaces de coger una pequeña parte del ADN viral, modificarlo e integrarlo dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esa forma, si esa bacteria o su descendencia se encuentra con ese mismo virus, ahora inactivará de forma mucho más eficiente al material genético viral. Es, por lo tanto, un verdadero sistema inmune de bacterias”. (ver Figura 6) (Moran, 2015)

Esto puede aplicarse al ADN de eucariotas, con un CRISPR-Cas9 sintético y en un laboratorio, conociendo la secuencia que se desea cambiar, se puede generar un ARN complementario a dicha secuencia y agregarla al CRISPR-Cas9, el cual termina cortando esta sección. Luego pueden ocurrir dos posibles resultados derivados de las dos grandes vías existentes para la reparación del ADN, y estos son la vía de unión de extremos no homólogos, cuya sigla en inglés es NHEJ, que presenta tendencia a errores y la vía de reparación dirigida por homología cuya sigla en inglés es HDR y es la que presenta una mayor fidelidad, así que puede optarse por una u otra dependiendo del resultado que se busque con respecto a la modificación de ese gen.

Figura 7. La edición de genomas a través de ARN guía-CAS9. La nucleasa Cas9 y la guía de ARN, debe ser primero introducida en la célula diana. Esto se logra mediante introducción por ingeniería genética. El ARN guía dirige a Cas9 para unir secuencias de ADN diana. En el blanco se forma una burbuja que debe estar flanqueada por un adecuado motivo adyacente (PAM;Motivo adyacente de protoespaciador), con secuencia NGG, que refiere a que N es cualquier nucleobase seguida de dos nucleobases de Guanina. Sí el ARN guía es idéntica con solo unos desajustes en el extremo 5 ́del espacio de hibridación, Cas9 cortará las dos cadenas del ADN generando extremos romos. Si se suministra con una plantilla de reparación que contiene los cambios deseados y homología a las secuencias a ambos lados de la ruptura, la célula puede utilizar la recombinación homóloga para reparar la ruptura mediante la incorporación de la plantilla de la reparación en el cromosoma. De lo contrario, la ruptura será reparada uniendo los extremos, lo que resulta en la pérdida de algunos nucleótidos y la interrupción del gen. Fuente: Noguez Moreno, et al.,2017

 

La activación de la vía NHEJ ocurre cuando no hay presencia de un molde reparador, así las DSB (Double Strand DNA Break) son unidas dejando “cicatrices” en forma de deleciones o adiciones, es decir, mutaciones. De esta manera se usa la vía NHEJ para producir “knockout” génico sobre secciones indeseables del ADN, al exponer codones de stop de manera prematura.

La activación de la vía HDR, si bien es mucho más precisa, ocurre a frecuencias mucho más variables que NHEJ, y suele activarse naturalmente en células que se están dividiendo, además su eficiencia puede variar dependiendo del tipo de célula y su estado de división, así como del lugar y amplitud del segmento modificado de ADN. La vía HDR produce modificaciones muy puntuales y definidas sobre un locus frente a un molde reparador introducido exógenamente, el cual puede ser la clásica doble hebra de ADN complementario y antiparalelo o una sola hebra de ADN, este último método puede ser útil para introducir mutaciones de segmentos extremadamente pequeños (tan chicos como un solo nucleótido) dentro del genoma, de manera simple y rápida.(Ann Ran, et al., 2013)

Quizás la propiedad más importante es que CRISPR-Cas9 puede no solo cortar, sino que (por medio de modificaciones artificiales dentro del laboratorio) introducir una nueva secuencia de ADN y por lo tanto, nuevos genes dentro de la cadena, permitiendo un gran abanico de alteraciones sobre prácticamente cualquier organismo. En este caso se planteará el uso teórico de CRISPR-Cas9 tipo 2, el cual utiliza crARN (CRISPR ARN asociado), que actúa como guía codificante para ARN, y otro segmento de crARN de trans-activación o trancrARN, el cual facilita el proceso. Cada uno de estos crARN está compuesto de una secuencia de 20 nucleótidos guia.(Ann Ran, et al, 2013).

Un estudio realizado por Gantz, et al., en 2015 estudia o analiza  la modificación de Anopheles stephensi por medio de CRISPR-Cas9 y la producción de MTs, al alterar genéticamente uno de los cromosomas de los machos, luego copiaron el segmento de 17.000 pares de bases al cromosoma homólogo utilizando la vía de reparación HDR de una manera exacta y en un sitio específico del ADN, de esta manera y junto a la deriva génica producida en la naturaleza, se logró una incidencia del 99,5% aproximadamente de la frecuencia del gen sobre la descendencia de la cruza entre los machos transgénicos y las hembras salvajes. En contraste con esto, se encontró que la modificación sólo en las hembras no conlleva al mismo éxito, debido a que los cromosomas no son reparados por la vía HDR, más exacta, sino por NHEJ; Así es como se producen muchas mutaciones en el proceso y por lo tanto, se termina dando una herencia de tipo pseudo mendeliana de los genes modificados, y no tiene el mismo éxito, de esta manera se estima que se podría lograr la erradicación de la enfermedad en unas 10 generaciones de mosquitos, es decir, en un periodo de aproximadamente 1 año. Este modelo que es completamente teórico está basado en el uso exclusivo de mosquitos machos transgénicos liberados al medio ambiente ya que ellos son quienes tienen la posibilidad de generar una deriva génica, aunque hay un cierto aporte por parte de la descendencia de las subsecuentes hembras modificadas hijas de los machos liberados.

Conclusiones y Comentarios Finales:

CRISPR-Cas9 es una poderosísima herramienta para poder moldear al mundo y los animales que lo habitan, pero tiene como limitación que es demasiado nueva y no ha sido testeada en el campo lo suficiente, de esta manera no termina habiendo una respuesta definitiva de si será o no la salvación a todas las ETV y otras enfermedades relacionadas, aun así el futuro necesitará cada vez más nuevas y mejores estrategias para combatirlas, y más si se considera que el presupuesto de la OMS con la ETM debe duplicarse de 3 mil millones actuales a 6 mil millones en menos de un año si se quiere seguir con el plan estimado, es decir, reducir el paludismo en un 40% para el 2030.  Tal vez la deriva génica dada por los mosquitos transgénicos no sea la respuesta, pero todavía es demasiado pronto para decirlo, ya que si bien es fácil quitar una proteína o lípido que es aprovechado por un virus o un parásito, esto es biología, pero nada cumple solo una función ni es simplemente tan fácil, debido a que esa proteína podría cumplir muchas otras funciones importantes en otro lado, así que habrá que considerar los pros y contras, ¿cuáles podrían ser las futuras repercusiones ambientales?, ¿es factible económicamente hablando?, y tal vez más importante, ¿cuánto pesan estos argumentos frente al medio millón de personas que mueren al año?.

Bibliografía

Acceso. (2019). Retrieved from https://www.who.int/es

Ann Ran, F., & Scott, D. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system [Ebook].

Gantz, V. (2015). Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi [Ebook]. California.

Heymann, D. (2013). El control de las enfermedades transmisibles [Ebook] (19th ed., pp. 485-508). Washington DC.

Moran, A. (2015). ¿Qué es la tecnología CRISPR/Cas9 y cómo nos cambiará la vida? [Ebook].

Noguez Moreno, R. (2017). Nuevas estrategias de control vectorial:mosquitos transgénicos[Ebook]. México.

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Genotipos y susceptibilidad al scrapie (tembladera) en ovejas. Ejercitación resuelta

El scrapie es una enfermedad neurodegenerativa, causada por un prión que afecta a ovejas y ocasionalmente a cabras. En los ovinos, el genotipo del animal influye completamente en la incidencia de la enfermedad. Las ovejas genéticamente susceptibles resultan infectadas pero no desarrollan la enfermedad durante varios años. Los priones son proteínas infecciosas que aparentemente se reproducen al convertir una proteína celular normal en copias del prión. La proteína celular, llamada PrPc, se encuentra en la superficie de las neuronas.

En los ovinos, la transmisión y el desarrollo de la enfermedad clínica dependen del genotipo del hospedador. La susceptibilidad o la resistencia a la forma clásica de scrapie están relacionadas con los polimorfismos en el gen PrP en los codones 136, 154 y 171. Estos tres codones se encuentran en una parte de la proteína que puede sufrir cambios estructurales durante la conversión de PrPc a PrPSc, la forma aberrante e infectiva. En el codón 136, la alanina (A) está vinculada con la resistencia al scrapie y la valina (V) está asociada con la susceptibilidad. En el codón 154, la histidina (H) está vinculada con la resistencia y la arginina (R) está asociada con la susceptibilidad. En el codón 171, la arginina (R) está vinculada con la resistencia, mientras que la glutamina (Q) y histidina (H) están asociadas con la susceptibilidad. Aunque otras combinaciones son posibles desde un punto de vista teórico, sólo cinco alelos PrP son frecuentes en ovejas: A136R154R171 (abreviado ARR), ARQ, AHQ, ARH y VRQ.

En base al texto anterior, conteste las siguientes preguntas

  1. Diseñe una técnica que permite identificar los alelos presentes en su rebaño.
  2. Qué genotipos de ovejas seleccionaría en su rebaño para tener una mayor seguridad de que son resistentes o tienen baja susceptibilidad de desarrollar scrapie? Cuáles serían los fenotipos intermedios y los más susceptibles a scrapie.
  3. Si sospecha que en su establecimiento hay portadores de los alelos susceptibles, cómo procedería para identificarlos? ¿Qué decisión tomaría respecto de los mismos?

Fuente:

  • The Center for Food Security and Public Health. Iowa State University (2007). Scrapie. Enfermedad del temblequeo o mordisqueo.

ACTIVIDAD RESUELTA

 1. Diseñe una técnica que permite identificar los alelos presentes en su rebaño.

Para la identificación de alelos, nos podemos valer de la técnica denominada RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) o polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción. El primer paso consiste en diseñar primers que apareen a regiones conservadas del gen que codifica para la proteína PrP, y luego analizar la secuencia, para determinar que enzimas de restricción me permitirían discriminar por medio de distintos puntos de corte en las variantes alélicas de los codones 136, 154 y 171 que puedan visualizarse en un gel de agarosa.

2. ¿Qué genotipos de ovejas seleccionaría en su rebaño para tener una mayor seguridad de que son resistentes o tienen baja susceptibilidad de desarrollar scrapie? ¿Cuáles serían los fenotipos intermedios y los más susceptibles a scrapie.

La susceptibilidad o la resistencia a la forma clásica de scrapie están relacionadas con los polimorfismos en el gen PrP en los codones 136, 154 y 171. En el codón 136, la alanina (A) está vinculada con la resistencia al scrapie y la valina (V) está asociada con la susceptibilidad. En el codón 154, la histidina (H) está vinculada con la resistencia y la arginina (R) está asociada con la susceptibilidad. En el codón 171, la arginina (R) está vinculada con la resistencia, mientras que la glutamina (Q) y histidina (H) están asociadas con la susceptibilidad.

Para facilitar el análisis del nivel de susceptibilidad o resistencia del alelo es más simple organizar una tabla con los diferentes cambios en los codones 136, 154 y 171  que da lugar a la sustitución con distintos aminoácidos:

Tabla codones scrapie

A simple vista, el alelo que tenga en los codones 136, 154 y 171 los aminoácidos A, H y R, respectivamente, sería el que  conferiría un mayor nivel de resistencia. Mientras que por el contrario, el más susceptible sería el que tenga en esas mismas posiciones, los aminoácidos V, R y Q/H.

Si bien lo anterior es un modelo teórico, en el cual todas las combinaciones serían posibles, sólo cinco alelos PrP son frecuentes en ovejas: A136R154R171 (abreviado ARR), ARQ, AHQ, ARH y VRQ.

Por lo que en mi rebaño seleccionaría las ovejas que posean los alelos: ARR, AHQ y/o ARH, los cuales combinan para dos de las tres posiciones en los codones, 2 aminoácidos que otorgan mayor resistencia.

En cambio, un fenotipo intermedio sería el que posea el alelo  ARQ, y el más susceptible al scrapie, el alelo VRQ ó VRH.

3. ¿Si sospecha que en su establecimiento hay portadores de los alelos susceptibles, cómo procedería para identificarlos? ¿Qué decisión tomaría respecto de los mismos?

La identificación se puede realizar mediante la toma de muestra para hacer una extracción de ADN, y genotipificar mediante RFLP (tal como se explicó en el punto 1).

Aquellos animales con susceptibilidad aumentada, deben mantenerse apartados del resto del rebaño, y realizarles un seguimiento para evaluar sintomatologías típicas de scrapie. Evitar usar hembras de reemplazo con este genotipo para evitar la prolifereación en el rebaño de alelos susceptibles. Asimismo, el macho a usar debería tener al menos uno de los genotipos de mayor resistencia.

El riesgo de ingreso de scrapie puede reducirse si se mantiene un rebaño cerrado o si se limita al mínimo la compra de animales fuera del territorio. Si deben incorporarse animales de reemplazo, éstos deben proceder exclusivamente de rebaños que dieron negativo para esta enfermedad. El empleo de genotipos resistentes al scrapie también disminuye el riesgo de contagio de la forma clásica de scrapie, aunque pueden ocurrir formas atípicas en estos animales, incluso en aquellos con genotipos ARR/ARR sumamente resistentes.

Detectives moleculares de alimentos. Ejercitación resuelta

Introducción: Las aplicaciones de la técnica de PCR en el control de alimentos son numerosas. Se pueden utilizar para identificar especies cárnicas y especies de pescado de interés alimenticio, detectar la presencia de agentes patógenos en los alimentos (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7) o detectar la presencia o ausencia de organismos genéticamente modificados (OGMs) en los alimentos.

En la siguiente figura se muestra el resultado obtenido al amplificar por PCR un gen universal presente en todas las especies animales. En este ensayo, cada especie genera una banda de amplificación de un tamaño determinado.

En la Figura 1 puede observar que las calles control (1 a 6) correspondientes a cabra, pollo, vaca, oveja, cerdo y caballo pueden compararse con las muestras problema (calles 7 a 12). Las calles 7 a 12 corresponden a distintos alimentos, en los cuales se quiere determinar qué tipo de carne poseen.

gel agarosa

Teniendo en cuenta el tamaño relativo de los genes amplificados en las muestras control, ¿podría decir qué producto animal poseen los alimentos A (calles 7 y 8), B (calles 9 y 10) y C (calles 11 y 12)?

ACTIVIDAD RESUELTA

Respuestas:  Al comparar los tamaños alélicos, se puede concluir que:

  • La muestra A (calles 7 y 8) contiene pollo,
  • La muestra B (calles 9 y 10) contiene en su composición carne de pollo, vaca y cerdo.
  • La muestra C (calles 11 y 12), al igual que la muestra A, contiene sólo carne de pollo.

Análisis de marcadores moleculares microsatélites. Ejercitación resuelta

Se propone observar el esquema de la Figura 1 y responder las preguntas.

  1. ¿Qué característica tiene el marcador molecular, que hace que sea considerado un VNTR?
  2. ¿Qué técnica permite amplificar la región VNTR?
  3. ¿Qué significan los segmentos lineares rojos y las flechas contiguas a la región VNTR?
  4. ¿Qué técnica permite discriminar o diferenciar los fragmentos amplificados que poseen distinto tamaño? ¿A qué se deben las diferencias en los tamaños de dichos fragmentos de ADN?
  5. En el esquema del gel, ¿cuántas muestras de ADN de diferentes individuos se han incluido en el análisis?
  6. ¿cuántos alelos hay en este conjunto de 5 individuos? ¿Cuál es el de mayor tamaño? ¿Y el de menor?
  7. ¿Cuál es el número máximo de alelos que puede tener un individuo diploide? Describir qué individuos son homocigotas o heterocigotas y qué alelos poseen.

esquema VNTR

Esquema de un VNTR o microsatélite. Fuente: Porque biotecnología

ACTIVIDAD RESUELTA

  1. Las lineas rojas adyacentes a la región del microsatélite, representa a la cadena de ADN que lo rodea. Esta secuencia de ADN debe conocerse para poder diseñar los primers (segmentos de ADN de simple cadena, señalados con flechas rojas en el esquema) complementarios a dicha secuencia. Los primers a derecha e izquierda del microsatélite determinarán los extremos de la región del ADN del que se obtendrán millones de copias luego de realizar la PCR.



  2. La diferencia en tamaño de los fragmentos de ADN está dada por el diferente número de repeticiones de las secuencias en tandem. A cada fragmento de diferente tamaño se lo llama alelo. Por ejemplo, en el esquema se muestra un alelo de 10 repeticiones. Se debe tener en cuenta que en individuos dipolides (2n), en cada locus, se encuentran 2 regiones microsatélites (una en cada cromosoma homólogo). Si el individuo posee dos microsatélites del mismo tamaño, se lo considera homocigota para ese locus, si en cambio las regiones microsatélites en los dos cromosomas homólogos son diferentes, el individuo es heterocigoto para ese locus. Una manera de separar los fragmentos (alelos) de diferente tamaño, es por medio de electroforesis en geles (de agarosa o acrilamida). El ADN, que tiene carga neta negativa, migrará hacia el polo positivo del campo eléctrico creado a través del gel. Debido a la porosidad de dichos geles, las moléculas más grandes (alelos con mayor número de repeticiones) quedarán retrazadas en el gel y correrán menos (más cerca del polo negativo), mientras que las más pequeñas se desplazarán más.


  3. Se incluyeron ADNs de 5 individuos, en los cuales se realizó previamente la PCR, para amplificar la región microsatélite.

  4. Hay 3 alelos de diferentes tamaños (indicados como alelos A, B y C). El alelo de mayor tamaño es el A (corre menos en el gel), mientras que el de menor tamaño es el C.

  5. Un individuo diploide posee 2 alelos. Si los dos alelos son del mismo tamaño (se ven como una única banda en el gel) se dice que es homocigota, mientras que si los dos alelos son diferentes, es heterocigota para ese locus.

  6. Individuo 1: homocigota, posee 2 alelos iguales (B); indiv. 2: heterocigota con los alelos B y C; indiv. 3: homocigota, con el alelo A; indiv. 4: homocigota para el alelo C; indiv. 5: heterocigota, con los alelos A y B.

  7. Un individuo diploide posee 2 alelos. Si los dos alelos son del mismo tamaño (se ven como una única banda en el gel) se dice que es homocigota, mientras que si los dos alelos son diferentes, es heterocigota para ese locus. Individuo 1: homocigota, posee 2 alelos iguales (B); Individuo 2: heterocigota con los alelos B y C; Individuo 3: homocigota, con el alelo A; Individuo 4: homocigota para el alelo C; Individuo 5: heterocigota, con los alelos A y B.

Genes de terneza. Ejercitacion resuelta

Introducción: La calidad de la carne constituye un importante factor de interés económico y es la terneza, el atributo más apreciado por los consumidores de todo el mundo. Sin embargo, es una característica de compleja medición en el momento de la faena.

Hoy la Argentina está a la vanguardia, junto con Australia y Estados Unidos, en los análisis que determinan la capacidad genética de los rodeos para producir carne tierna.

Trabajos científicos de los últimos años han demostrado que el “tiernizado” “post mortem” de las carnes se debe a la existencia de dos enzimas, Calpaína y Calpastatina que actuando en forma coordinada degradan las fibras musculares quitándoles el “rigor mortis” luego de la faena. La Calpaína es la enzima principal de estos procesos de maduración y las variantes más activas de la enzima confieren mayor terneza a la carne. La Calpastatina codifica para una fosforilaza, enzima inhibidora de la calpaína, según el estado alélico en que se encuentre. En forma inversa a la anterior, en este caso las variantes menos activas de esta enzima confieren mayor terneza.

Para cada marcador se ha encontrado una variante más favorable a la terneza (+) y una menos favorable (-). Al tener los bovinos dos alelos de cada gen, uno proveniente del padre y otro de la madre, para un animal hay entonces tres genotipos posibles para cada marcador.

En la actualidad el componente genético de la terneza se explica con la presencia de 4 mutaciones, 2 en el gen de Calpastatina (Calpastatina 2959 y Calpastatina UoG) y 2 en el gen de Calpaína (Calpaína 316 y Calpaína 4751). Por ejemplo, para el gen de la calpaína, la mutación en la posición 316 corresponde al cambio de una base en el ADN (citosina por guanina), que produce un cambio en la estructura de la proteína al reemplazar el aminoácido alanina (GCC) por glicina (GGC).

Dado que estos genes se heredan en forma mendeliana, es importante incluir en la ficha de cada animal tanto machos como hembras su genotipo para Calpaína y Calpastatina y su Índice de Terneza combinado. La información de los genes de terneza (genotipo) se incorpora en Resumen de Padres ANGUS (Catálogos).

Es importante remarcar, que estos marcadores son mas relevantes en la comercialización de carne fresca, es decir aquella que se comercializa cerca de la faena. En nuestro país, 80 %  de la faena tiene como destino el Mercado Interno, dentro de esta modalidad.

Analizando lo anteriormente expuesto, contestar:

  1. ¿Cuáles son las características que se desean mejorar en el ganado vacuno destinado a consumo?
  2. ¿Por qué es posible mejorar esta característica en el ganado?
  3. ¿Cuál es el método tradicional para medir terneza? ¿qué aportan los marcadores moleculares en ésta área?
  4. ¿Cuáles son los marcadores moleculares ligados a la cualidad de terneza de la carne? ¿Qué rol juegan estas enzimas en el proceso de tiernización de la carne?
  5. ¿Qué beneficio trae el conocimiento de estos genes al mejoramiento de esta raza vacuna?
  6. ¿Cuál es el número de alelos favorables [+] considerando que son 4 los marcadores moleculares disponibles para los genes de terneza?
  7. Dado que la capacidad de predecir terneza de los cuatro marcadores es aditiva, a mayor cantidad de las variantes más favorables, mayor probabilidad de obtener individuos con carne tierna. Indique una metodología que pueda emplearse en la detección del número de alelos favorables para la selección de reproductores por terneza.

Bibliografía: Adaptado de:

Guitou, Horacio (2010). Marcadores Moleculares de Terneza: CALPAÍNA Y CALPASTATINA. Una nueva herramienta para el mejoramiento genético de los rodeos bovinos de carne. Revista AnGus 249. Pág. 73-77.

ACTIVIDAD RESUELTA

¿Cuáles son las características que se desean mejorar en el ganado vacuno destinado a consumo?

Para poder contestar esta pregunta, se sugiere buscar información bibliográfica. Ejemplo, del Instituto de Promoción de la Carne Vacuna Argentina (IPCVA).

Los productores desean seleccionar a los mejores animales para lograr una mayor área de ojo de bife, menor cantidad de grasa dorsal o menor porcentaje de grasa intramuscular. A estas características de interés para los consumidores, se sumó la terneza de la carne. La terneza de la carne se define, como la dificultad o la facilidad con la que una carne se puede cortar o masticar.

¿Por qué es posible mejorar esta característica en el ganado?

El mejoramiento es posible porque esta característica se encuentra gobernada por ciertos genes, con lo cual la terneza es un carácter heredable, sensible al mejoramiento.

Además, estos genes se heredan en forma mendeliana, y la descripción del genotipo para estos genes de terneza ya se está incluyendo en el Resumen de Padres ANGUS (Catálogos).

¿Cuál es el método tradicional para medir terneza? ¿qué aportan los marcadores moleculares en ésta área?

El método de “Warner-Bratzler” es el tradicional para medir la terneza de la carne y consiste en cortar la carne con una guillotina al momento de la faena y medir la fuerza de corte en kilogramos. Debido a que este método es poco práctico en estudios genéticos en donde se deben medir los caracteres en los progenitores y la progenie, la utilización de los marcadores moleculares permite ganar en tiempo y en costo y evita la faena de ejemplares.

¿Cuáles son los marcadores moleculares ligados a la cualidad de terneza de la carne? ¿Qué rol juegan estas enzimas en el proceso de tiernización de la carne?

Los marcadores moleculares son las distintas variantes alélicas de los genes que codifican para las enzimas Calpaína y Calpastatina. Las diferencias en los alelos se deben a mutaciones puntuales (SNPs o Single Nucleotide Polymorfhism).

Trabajos científicos de los últimos años han demostrado que el “tiernizado” “post mortem” de las carnes se debe a la existencia de dos enzimas, Calpaína y Calpastatina que actuando en forma coordinada degradan las fibras musculares quitándoles el “rigor mortis” luego de la faena. La Calpaína es la enzima principal de estos procesos de maduración y las variantes más activas de la enzima confieren mayor terneza a la carne. La Calpastatina codifica para una fosforilaza, enzima inhibidora de la calpaína, según el estado alélico en que se encuentre. En forma inversa a la anterior, en este caso las variantes menos activas de esta enzima confieren mayor terneza.

¿Qué beneficio trae el conocimiento de estos genes al mejoramiento las raza vacunas?

La identificación en las diferentes razas bovinas de mutaciones puntuales (SNPs o Single Nucleotide Polymorfhism) asociadas a variantes genéticas de mayor o menor terneza en los genes de CALPAÍNA y CALPASTATINA, ha sido el puntapié inicial para el mejoramiento genético de los rodeos en lo que respecta a la terneza de su carne. Los animales que poseen las variantes más favorables de cada gen tienen más probabilidades de generar carne tierna que los que poseen las variantes menos favorables.

¿Cuál es el número de alelos favorables [+] considerando que son 4 los marcadores moleculares disponibles para los genes de terneza?

El componente genético de la terneza se explica con la presencia de 4 mutaciones, 2 en el gen de Calpastatina (Calpastatina 2959 y Calpastatina UoG) y 2 en el gen de Calpaína (Calpaína 316 y Calpaína 4751).

Un individuo como máximo puede presentar las 8 variantes favorables (individuo diploide).

Entre los individuos con los genotipos más y menos favorables (8 genes favorables vs 0 genes favorables), existe una diferencia en la terneza de más de 1,4 Kg (30%) medida con el método de Resistencia al Corte de Warner – Bratzler a los 14 días post faena. Las VARIANTES MÁS FAVORABLES de un gen o marcador se designan [+] y las MENOS FAVORABLES [-], los bovinos poseen una copia de cada gen provenientes del padre y otra de la madre, el genotipo óptimo de cada gen o marcador es [++], el genotipo intermedio es [+ -] y el genotipo menos favorable es [- -]. Un GENOTIPO [++] significa que el animal que lo posee es homocigota para la variante de mayor terneza para los dos genes y por lo tanto es un individuo con un 100% de capacidad para transmitir dichas características genéticas a su descendencia.

Dado que la capacidad de predecir terneza de los cuatro marcadores es aditiva, a mayor cantidad de las variantes más favorables, mayor probabilidad de obtener individuos con carne tierna. Indique una metodología que pueda emplearse en la detección del número de alelos favorables para la selección de reproductores por terneza.

Para la detección e identificación de las variantes alélicas de los genes que codifican para calpaína y calpastatina, respectivamente, se puede diseñar una metodología que abarque la amplificación por PCR de ambos genes, y una digestión con enzimas de restricción que permita discriminar que variante alélica está presente, siempre y cuando las mutaciones coincidan con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción conocidas, creando un sitio nuevo, y/o eliminando otro existente. Por ejemplo, para el gen de la calpaína, la mutación en la posición 316 corresponde al cambio de una base en el ADN (citosina por guanina), que produce un cambio en la estructura de la proteína al reemplazar el aminoácido alanina (GCC) por glicina (GGC).  Alternativamente, se puede mandar a secuenciar el fragmento amplificado.

 

Enfermedades raras y epigenética

La epigenética desde hace uno años, ha sido objeto de profunda investigación. Son cambios en la regulación de la expresión de los genes, que se dan por modificaciones químicas del ADN (por ejemplo : metilaciones). Algunas enfermedades raras son de las estudiadas. Les dejo un video del Prof. Manel Esteller. Director del Programa de Epigenética y Biología del Cáncer del Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge (IDIBELL)

Fuente: Una de cada cuatro enfermedades minoritarias presenta alteraciones de un gen epigenético.

Para saber más y leer sobre este tema: la entrevista completa aquí

Actividad de aprendizaje de Marcadores Moleculares: Detección de un defecto genético en bovinos mediante pruebas de ADN

Introducción: El conocimiento del genoma bovino y la utilización de marcadores de ADN han permitido conocer el origen de algunas enfermedades hereditarias y desarrollar técnicas de diagnóstico precoz. Mediante el aislamiento de ADN a partir de muestras nucleadas y técnicas de amplificación in vitro y digestión con enzimas de restricción se puede diagnosticar si un animal es portador de un gen letal o mutante para determinadas características. En la actualidad es posible estudiar enfermedades hereditarias del ganado bovino lechero como la deficiencia de adhesión leucocitaria bovina (BLAD).

La deficiencia en la capacidad de unión de leucocitos bovinos a los antígenos, más conocida como BLAD (Bovine Leuckocyte Adhesion Deficiency), es causante de la muerte de animales de la raza Holstein a los pocos meses de nacer (de 2 a 8 meses) debido a una susceptibilidad aumentada a la acción de agentes infecciosos. Su principal característica es ser una enfermedad autosómica recesiva que puede ser transmitida a la descendencia.

Se conoce la secuencia del gen normal que codifica para la subunidad β de las integrinas de la proteína bovina CD18 y se ha identificado el alelo bovino CD18 defectuoso.

La amplificación del ADN mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) específica para dicho locus, y posterior digestión del fragmento amplificado (101 bp) en forma separada con las enzimas de restricción Taq I y Hae III, permite visualizar en gel de agarosa al 4% los fragmentos de restricción.

En base al esquema de la Fig. 1, completar el cuadro 1 con el tamaño de los fragmentos de restricción esperados para muestras obtenidas de animales sanos (TL), portadores (BL) y enfermos (BLAD).

Patron de restricción alelos BLAD.jpg

        Figura 1. ADN amplificado y efecto de la digestión con enzimas de restricción

 

Cuadro 1. Patrón de las bandas de los fragmentos de restricción (pb) posterior a la digestión con enzimas Taq I y Hae III.

Tabla para completar ejercicio 1.jpg

 

ACTIVIDAD RESUELTA

La amplificación por PCR tanto del gen CD18 normal y su alelo defectuoso resulta en un fragmento de 101 pares de bases (pb). Sabemos, además, que hay tres genotipos/fenotipos posibles:

  • TL/TL= homocigota (Normal);
  • TL/BL= Heterocigoto (Normal, portador); 
  • BL/BL= Homocigoto (enfermo)

Fig 1 Resoluc.jpg

esquema de restriccion

Por lo que sí, posterior a la amplificación, el producto de 101 pares de bases se somete a digestión con Hae III, el alelo BL se corta en 3 fragmentos: 46, 19 y 36 pares de bases. En cambio, el alelo normal, TL, solo se corta en 2 fragmentos: 65 y 36 pares de bases.

Imagen1

Por lo que sí, posterior a la amplificación, el producto de 101 pares de bases se somete a digestión con Taq I, el alelo BL se corta en 2 fragmentos: 84 y 17 pares de bases. En cambio, el alelo normal, TL, solo se corta en 3 fragmentos: 52, 32 y 17 pares de bases.

En base al análisis previo de cómo se fragmentan cada uno de los alelos con ambos tipos de enzimas, podemos completar el Cuadro 1.

Cuadro 1. Patrón de las bandas de los fragmentos de restricción (en pares de bases) posterior a la digestión con enzimas Taq I y Hae III.

cuadro 1 resuelto.jpg

Recordar que las bandas migran en el gel de agarosa en función de su peso: Las de mayor pesa se ubican en la parte superior del gel, o lo que es lo mismo, más próximos al pocillo de siembra. Recordar sembrar un marcador de Peso Molecular que permita identificar el tamaño de las bandas.

Como ejemplo, se explica en detalle como completar las columnas 2, 3 y 4, en la que se usa Taq I.

  • Un individuo homocigota normal, es decir, genotipo TL/TL: de cada alelo se amplifica idéntica secuencia, por poseer copias idénticas del gen, por lo que la digestión del ADN dará solamente las bandas de tamaño: 52, 32 y 17 pares de bases.
  • Un heterocigota portador, es decir, genotipo TL/BL: de cada alelo se amplifica distinta secuencia, por lo que la digestión del ADN dará una mezcla de las bandas obtenidas de la digestión del alelo TL (52, 32 y 17 pares de bases) y del alelo BL (84 y 17 pares de bases), es decir, en total se observarán CUATRO BANDAS: 84, 52, 32 Y 17 pares de bases (el fragmento de 17 pares de bases es común a ambos alelos).
  • Un homocigota Enfermo, es decir, genotipo BL/BL: de cada alelo se amplifica idéntica secuencia, ya que es homocigota, por lo que la digestión del ADN dará solamente las bandas de tamaño: 84 y 17 pares de bases.

Plataforma de intercambio entre científicos “The Hive”

the-hiveHola a todos, en esta ocasión quería presentarles a todos lo que hacen ciencia o necesiten consejos sobre ciertas técnicas, la aparición de una plataforma llamada The Hive, que según ellos mismos relatan:

“Pablo Acera y Francisco Arias son sus creadores y son dos científicos españoles con experiencia en el campo de la investigación. Tras sus propias vivencias, ambos llegaron a la conclusión de que en algunos momentos de estas mismas investigaciones los resultados no eran los esperados y se veían ralentizados por la falta de dominio de las técnicas empleadas. Para solventar este problema, decidieron crear una plataforma online donde los usuarios están segmentados según las técnicas que dominan y donde la colaboración entre científicos es simple y rápida.

La página funciona como un foro de preguntas y respuestas filtradas por técnicas donde también es posible la comunicación por chat privado. Con este nuevo enfoque, pretendemos fomentar la colaboración entre científicos y, ante todo, hacer que encontrar al profesional adecuado sea lo más fácil posible.”

 

Así que les presento a The Hive, que es el link donde la encontrarán, pueden incluso usar las redes sociales para identificarse y es muy simple de usar.

En este enlace os dejo el comunicado de prensa oficial con el que presentamos la idea: https://www.thehiveplace.com/media/comunicado.pdf

Espero les sea útil

 

Saludos

Gaby

Talasemia. Monografías de alumnos

Hoy quería dejarles la monografìa realizada por Mariana de Gregorio acerca de la Talasemia. Espero esto les sirva a todos los que busacn información del tema

Saludos

Gaby

 

Trabajo final de

Genética básica.

TALASEMIA.

 

Alumna: Mariana De Gregorio Paolasini.

Profesora: Gabriela Iglesias.

Fecha: 3 de Noviembre del año 2015.

Universidad: Nacional de Rio Negro.

Curso:  Genetica básica, Tercer año.

Carrera: Medicina veterinaria

 

Introducción:

En la sangre encontramos distintos tipos celulares, entre ellos, los eritrocitos, los cuales representan el número más abundantes de células  de la sangre, y que tienen como componente principal la hemoglobina , cuya función es transportar el oxígeno hacia los diferentes tejidos del cuerpo.  Participa en el proceso por el que la sangre lleva los nutrientes necesarios hasta las células del organismo y conduce sus productos de desecho hasta los órganos excretores. También transporta el oxígeno desde los pulmones (o desde las branquias, en los peces), donde la sangre lo capta, hasta los tejidos del cuerpo.

Los eritrocitos son producidos continuamente en la médula ósea de los huesos largos principalmente.  Tienen una forma oval, bicóncava, aplanada, con una depresión en el centro; diseño óptimo para el intercambio de oxígeno con el medio, ya que le otorga flexibilidad para poder atravesar los capilares, donde liberan la carga de oxígeno.

El diámetro de un eritrocito típico es de 6-8 µm.

Los valores considerados normales de eritrocitos en adultos son:
  • Mujeres: 4 – 5 x 106/mL(mililitro) de sangre
  • Hombres: 4,5 – 5,5 x 106/mL(mililitro) de sangre. wikipedia.org,. (2015).

Un  déficit o disminución por debajo del rango de referencia de los eritrocitos  genera un estado patológico  denominado anemia,  cuya  alteración provoca hipoxia tisular. En cambio, un exceso de estos, se denomina policitemia, el aumento de la concentración de eritrocitos (eritrocitosis) es una patología mucho menos común.

Existen  alteraciones en la maduración de los eritrocitos, entre las cuales están la deficiencia de hierro y las anomalías genéticas que conducen a la producción de hemoglobinas anormales.

Entre las patologías que se pueden producir por anomalías genéticas esta la talasemia, trastorno sanguíneo hereditario.

En este trabajo se explicara que es la talasemia, se nombraran sus variedades, haciendo hincapié en una en particular, llamada β-talasemia, dentro de la que encontramos más de 200 tipos de mutaciones, de las que se explicaran las  más frecuentes en nuestro país.

Desarrollo:

En un sujeto normal, los glóbulos rojos tienen una duración de 120 días de vida. Cada día, el cuerpo produce nuevos glóbulos rojos para reemplazar los que han muerto o los que el cuerpo ha perdido.  En la talasemia, los glóbulos rojos se destruyen a una velocidad mayor generando anemia.

La talasemia ¨Es un trastorno sanguíneo que se transmite de padres a hijos (hereditario) en el cual el cuerpo produce una forma anormal de hemoglobina, la proteína en los glóbulos rojos que transporta el oxígeno¨. (Policlinicalacibis.es,. 2015).

Esta hemoglobina está compuesta por cuatro cadenas de polipeptidos, dos cadenas de globina alfa y dos cadenas de globina beta. Por lo que hay dos tipos de talasemia principales – talasemia alfa y talasemia beta – cuyo nombre viene de los defectos que pueden ocurrir en estas cadenas de proteínas.

Hay dos copias del gen que produce la hemoglobina α (HBA1 y HBA2), y cada uno codifica una cadena α, y ambos genes están localizados en el cromosoma16. El gen que codifica las cadenas β (HBB) está localizado en el cromosoma 11.  (Es.wikipedia.org,. 2015). 

 

 

hemo2

Figura 1: Molécula de hemoglobina. Estructura cuaternaria de globinas. Fundrepa.org

Lo que genera las siguientes patologías:

  1. Alfa talasemia:cuando el cuerpo tiene dificultades produciendo alfa globina
  2. Beta talasemia:cuando el cuerpo tiene dificultades produciendo beta globina

En la α-talasemia, el gen HBA1  y HBA2, del cromosoma 16,  hay una deficiencia de síntesis de cadenas α. El resultado es un exceso de cadenas β que trasportan deficientemente el oxígeno, lo que conduce a bajas concentraciones de O2 (hipoxemia).

Paralelamente, en la β-talasemia  hay una falta de cadenas β, y el consiguiente exceso de cadenas alfa, que puede formar agregados insolubles que se adhieren a la membrana de los eritrocitos, pudiendo causar la muerte de éstos y sus precursores, originando anemia de tipo hemolítico.

Estas compensaciones  dan lugar a la formación de hemoglobinas inestables que provocan la destrucción de los glóbulos rojos y por lo tanto anemia. (Es.wikipedia.org,. 2015).

La talasemia se transmite de manera autosómica recesiva, afectando a los varones y mujeres igualmente, pues no implica el cromosoma de sexo  y se da cuando existe un defecto en un gen que ayuda a controlar la síntesis de una de las proteínas globulina  alfa o globulina beta  que componen la hemoglobina.

Sin título

Google.com.ar,. (2015)

 

Como se explico anteriormente, hay diversas formas de talasemia y cada tipo tiene muchos subtipos diferentes. Tanto la talasemia α como la talasemia β,  abarcan las siguientes dos formas, dependiendo la severidad de los síntomas:

  1. Talasemia menor.
  2. Talasemia mayor.

La talasemia menor se presenta  si uno recibe  el gen defectuoso  de solo uno de los padres. Las personas con esta forma de trastorno  son portadoras de la enfermedad y por lo general no tienen síntomas. En cambio, es necesario heredar el gen defectuoso de ambos padres para padecer la talasemia mayor.

Esta enfermedad está provocada por deleciones en uno o varios genes de los que componen los grupos de la α-globina y la β-globina. Según la cantidad de deleciones,  el tipo de talasemia será más o menos grave.

Existen otras deleciones  como resultado de entrecruzamientos desequilibrados entre los segmentos duplicados presentes en la región de la agrupación. (Es.wikipedia.org,. 2015).

Entrecruzamiento_desequilibrado (1)

Imagen de entrecruzamiento desequilibrado. Upload.wikimedia.org,. (2015)

 

Talasemia alfa:

La talasemia alfa ocurre cuando un gen, o los dos genes relacionados con la proteína globina α  de la hemoglobina faltan o se han modificado, mutado.  La alfa globina se genera en el cromosoma 16, por lo tanto, si los dos genes que le indican al cromosoma 16 que produzca alfa globina no se encuentran o han mutado, se produce menos alfa globina. Esto afecta la hemoglobina y disminuye la capacidad de los glóbulos rojos de transportar oxígeno por el cuerpo.

 

 

“Se necesitan cuatro genes, dos de cada padre, para hacer cadenas de proteína alfa. Cuando faltan uno o más de los genes, se produce la talasemia alfa. Este gráfico describe los diferentes tipos de talasemia.”

 

Genes alfa que faltan Problema Síntomas de anemia Otros nombres
1 Portador silencioso Ninguno Talasemia alfa – 2 rasgos, talasemia alfa mínima
2 Rasgos Leve Talasemia alfa – 1 rasgo, talasemia alfa menor
3 Hemoglobina H Moderados Enfermedad de la hemoglobina H
4 Seria Mortal Hidropesía fetal con la Hemoglobina de Bart

Clevelandclinic.org,. (2015).

 

  • Portador silencioso de alfa talasemia: un alelo del gen de la cadena alfa está delecionado (los otros tres son normales).  Genotipo  -/α α/α
  • Portador de alfa talasemia:perdida de dos alelos α, de los genes de cadena alfa, cualquiera ambos del mismo cromosoma 16, llamaron una canceladura de los “cis” o uno de ambos cromosomas 16, llamado una canceladura “trans.” Genotipo: -/- α/α or -/α -/α.
  • Enfermedad de la hemoglobina H: perdida de tres alelos α de los dos  genes de la cadena alfa están delecionados. La enfermedad de la hemoglobina H, produce una anemia. Las personas que tienen la enfermedad de la hemoglobina H corren un mayor riesgo de tener un hijo con alfa talasemia grave, puesto que son portadores de un cromosoma número 16 con dos genes delecionados de la cadena alfa (deleción en cis). Genotipo: -/- -/α
  • Alfa talasemia grave:pérdida de los cuatro alelos α, de ambos  genes de la cadena alfa, lo que es tan grave que puede producirse la muerte dentro del útero (antes del nacimiento). Genotipo: -/- -/-

Todos los casos posibles de talasemia alfa, según la ausencia de uno, dos, tres o cuatro genes de la alfa globina. Es.wikipedia.org,. (2015).

 

 

Ventajas de la talasemia α:

La α-talasemia protege a los individuos que la portan frente a la malaria. La malaria o paludismo está producida por un parásito protista del género Plasmodium y es transmitida por un mosquito del género Anopheles. La protección frente a esta enfermedad por parte de los individuos que posee α-talasemia es debida a que Plasmodium sólo es capaz de parasitar a los eritrocitos sanos. Sin embargo, la sangre de alguien con este tipo de anemia presenta un número elevado de eritrocitos deformes por culpa de que la hemoglobina no está bien constituida y eso es esencial pues deja al parásito indefenso en la sangre permitiendo que nuestro sistema inmunitario acabe con él.

 

Talasemia Beta

Normalmente hay dos genes de globina beta, uno heredado  de cada padre. La talasemia beta es un cambio en uno o los dos genes de globina beta, localiza en el cromosoma 11. Las mutaciones pueden suprimir completamente (mutaciones β0) o disminuir (mutaciones β+ y β++) la producción de cadenas β globina, lo que resulta en un desequilibrio en la síntesis de cadenas de globina α/β.

La magnitud de este, es la determinante principal del fenotipo de la enfermedad, que abarca desde los individuos asintomáticos (β-Talasemia  menor o portador) que agrupa a los genotipos heterocigotos (β+/P o β0/P) y que corresponde a la forma más frecuente en nuestro país,  hasta los que dependen de transfusiones regulares para vivir (β talasemia mayor) que comprende a los genotipos homocigotos (β00 y β++) o dobles heterocigotos (β0+), y corresponde a las formas de mayor expresividad clínica.

Entre ambos extremos, se encuentran los pacientes con β talasemia intermedia (BTI), en los cuales las manifestaciones clínicas son variables.

 

Este gráfico describe los diferentes tipos de talasemia beta.

 

Genes beta afectados Problema Síntomas de anemia Otros nombres
1 Portador silencioso Leve
1 Rasgo Leve
2 Intermedia Moderado
2 Mayor Severo Anemia de Cooley

Clevelandclinic.org,. (2015).

 

También existen casos de deleciones de diversos tamaños que pueden afectar al gen de la beta globina o a la región de control del locus.

Mayoritariamente es una enfermedad hereditaria con un patrón autosómico recesivo, pero también existen algunos casos donde la herencia es autosómica dominante.

También existen dos variedades de beta-talasemia (mayor o menor) según sea un déficit total o parcial de la síntesis (dependiendo la severidad de los síntomas): la talasemia mayor (también conocida como anemia de Cooley o anemia del mediterráneo) que es más severa y la talasemia intermedia.

Beta talasemia grave o MAYOR u homocigota (anemia de Cooley): los dos genes de la cadena beta tienen deleciones, causando el tipo más grave de beta talasemia. Los pacientes que tienen talasemia grave pueden fabricar suficientes glóbulos rojos  por lo que necesitan frecuentes transfusiones de sangre y puede que no vivan mucho tiempo. Durante el primer año o dos primeros años de vida, pueden estar pálidos, irritables, tener poco apetito y padecer muchas infecciones. Sin tratamiento, aumenta el tamaño del hígado, del bazo y del corazón, y los huesos pueden volverse delgados y quebradizos, desarrollan hemosiderosis (depósito en todos los tejidos del hierro liberado tras la hemólisis). Es frecuente la presencia de cálculos biliares por la hemólisis crónica. Adquieren un color pardo-verdoso por la anemia, la ictericia (la hemólisis libera bilirrubina que produce un color amarillo en la piel y mucosas) y la hemosiderosis. Se detiene el crecimiento, se retrasa la pubertad. Y finalmente se produce un fallo cardíaco.

Actualmente algunos pacientes pueden también ser tratados, e incluso curados, mediante un transplante de médula ósea.

 

Beta talasemia leve o característica de talasemia – un gen beta tiene una deleción, provocando anemia. La talasemia leve se divide en:

1.-Talasemia mínima  (la persona tiene pocos o ningún síntoma).

2.-Talasemia intermedia  (la persona tiene una anemia de moderada a grave).

 

-Beta Talasemia Intermedia: Se designa así al síndrome talasémico de moderada intensidad, que condiciona la aparición de una anemia leve y alteraciones óseas. Presentan sintomatología clínica y requieren transfusiones de sangre durante alguna época de su vida, pueden desarrollar hemosiderosis. Sus manifestaciones no son tan graves como en los pacientes afectados de la forma mayor de la enfermedad.

-Beta talasemia heterocigota o menor (rasgo talasemico): aparece cuando sólo está afectada una de las copias del gen que codifica la cadena. Es la mutación del gen beta, caracterizada por unos hematíes elevada, con concentración de hemoglobina normal o disminuida y generalmente presenta un aumento de la Hb A2. Las personas portadoras de talasemia menor, no presentan manifestaciones clínicas, aunque en ocasiones pueden tener una ligera anemia que se pone de manifiesto al realizar un análisis. Los glóbulos rojos de los portadores del rasgo talasémico son más pequeños de lo normal. La talasemia menor está presente desde el nacimiento, permanece durante toda la vida y puede transmitirse de los padres a los hijos.

Las β-talasemias además de la deleción del gen de la β-globina, también pueden darse por otras causas como:

  • Mutaciones en el promotor que detienen o reducen su transcripción.
  • Mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) que impiden la eliminación de losintrones.
  • Mutaciones en el sitio aceptor de poli-A que afectan al procesamiento del mesnajero ó mRNA.
  • Mutaciones de cambio en la pauta de lectura.

Es.wikipedia.org,. (2015).

O también pueden presentarse otras formas de talasemia beta cuando se hereda un gen para la beta talasemia en combinación con un gen de una variante hemoglobínica. Las más importantes son:

  • HbE: Si se hereda un gen de la HbE y uno de la beta talasemia, esta combinación es la responsable de la HbE-beta talasemia, apareciendo una anemia de moderada a severa similar a la beta talasemia intermedia.
  • HbS: beta talasemiaanemia falciforme. Si se hereda un gen de la HbS y otro de la beta talasemia, aparece la HbS-beta talasemia. es,. (2015).

 

Diagnostico para un paciente talasemico:

El diagnostico se puede realizar  con una única muestra de sangre, realizando:

  • Cuadro Hemático Completo (CBC), que incluye la medición de la hemoglobina y la cantidad/ tamaño de células rojas. La gente que sufre de talasemia tiene menos cantidad de células rojas sanas, menos hemoglobina de lo normal y dichos eritrocitos serán más pequeños e irregulares. (hemograma completo).
  • Un recuento de reticulocitos (medición de células rojas jóvenes) puede indicar que tu médula espinal no está produciendo el número adecuado de células rojas.
  • Los estudios del hierro indicarán si la causa de la anemia es una deficiencia de hierro (anemia ferropenica) o talasemia.
  • Se pueden usar pruebas genéticas o análisis mutacional para diagnosticar cuando hay un historial familiar de talasemia.
  • Electroforesis de la hemoglobina: es unprocedimiento de laboratorio que diferencia los tipos de hemoglobina presentes.
  • El médico lleva a cabo un examen físico para buscar un bazo inflamado (agrandado).

 

DIAGNOSTICO MOLECULAR- PCR:

El PCR es un método sencillo para el clonaje in vitro de cualquier segmento de ADN permitiendo disponer de forma rápida, eficaz y económica, de cantidades suficientes del mismo para su  posterior estudio molecular. Mediante esta  técnica, se realiza  la detección de los genotipos causantes de β-talasemia, ya que permiten discriminar entre alelos normales y mutantes que difieren en una sola base.

El método Amplificación Refractaria de Sistemas de Mutaciones (ARMS-PCR) es una modificación de la técnica de PCR,  utilizada para la detección de mutaciones puntuales causantes de β-talasemia. Esta técnica permite la amplificación enzimática de alelos específicos, mediante el uso de cebadores que están diseñados para discriminar entre secuencias que difieren en una única base. Además, utiliza cebadores control que amplifican otra región del gen de β globina, cercana a la mutación que será detectada, actuando como control interno de amplificación asegurando la eficiencia de la PCR y evitando falsos negativos.

Este es un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa, capaz de detectar diversas mutaciones puntuales y pequeñas deleciones o inserciones en el gen β globina, con el empleo de oligonucleótidos de secuencia específica.

 

 

Los productos obtenidos en la amplificación (PCR)  pueden analizarse mediante diversas técnicas:

 

https://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=imgres&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjpnaK939zJAhXKGJAKHZ3FB_EQjRwICTAA&url=http%3A%2F%2Fslideplayer.es%2Fslide%2F138610%2F&psig=AFQjCNGlrHnc5wtOs65GHix5t_7SlnCBIQ&ust=1450230428015774

  • Dot blot: se utiliza para detección de mutaciones puntuales mediante muestras de ADN hibridadas con sondas marcadas radiactivamente específicas de ciertas regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la región de interés se revelan (puntos oscuros).

 

  • Visualización del producto en geles de agarosa o poliacrilamida: se utiliza para separar los fragmentos de DNA basado en su tamaño.

http://slideplayer.es/slide/138610/

  • Análisis con enzimas de restricción: Las enzimas de restricción o endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
  • Secuenciación directa del ADN amplificado: determinación del orden de los nucleótidos (ACG y T) en un oligonucleótido de ADN

 

Las mutaciones más frecuentes en la población argentina del gen de β-globina son CD39 e IVS1-110, las cuales se dan a conocer mediante la técnica de ARMS-PCR.

  • IVS-I-110 (G>A)
  • CD 39 (C>T),

El diagnóstico molecular de β-talasemia, puede ser útil para brindar el asesoramiento genético entre parejas portadoras. La técnica de ARMS-PCR, reúne los requisitos necesarios de los métodos de diagnóstico: alta especificidad, reproducibilidad y bajo costo. Por lo tanto constituye un método eficaz para el diagnóstico de β-talasemia en pacientes sin posibilidad de estudio familiar, debido a la falta de uno de los padres.

Esta técnica no sólo permite detectar la mutación causante del padecimiento, sino también determinar si se encuentran en estado homocigoto o heterocigoto.

Los pacientes portadores de éstas (hetrerocigotos β/ βCD39 y β/βIVS1-110) y otras mutaciones β-talasémicas, son generalmente (salvo complicaciones) asintomáticos. Sin embargo, en estado homocigótico producen cuadros clínicos de mayor gravedad (Anemia de Cooley). De aquí la importancia de detectar a los individuos portadores, y en especial, aquellas parejas con probabilidades de concebir hijos con talasemia mayor, teniendo en cuenta las complicaciones que conlleva la herencia de dicha condición.  (Qbpatologica.files.wordpress.com,. 2015).

Tratamiento:

Los tratamientos estándar para los pacientes con talasemias serias son las transfusiones de sangre, quelación de hierro, extirpación del bazo, dosis diarias de ácido fólico, posible extirpación quirúrgica de la vesícula biliar, y trasplante de médula.

  • Las transfusiones de sangre cada 4 meses en los pacientes con talasemias moderadas o severas, y cada 2 a 4 semanas para los pacientes con talasemia seria beta. Se pueden necesitar transfusiones ocasionales para la enfermedad de la hemoglobina H o la talasemia intermedia beta.
  • La quelación del hierro: extirpación del exceso de hierro del cuerpo. Uno de los riesgos de las transfusiones de sangre es que pueden causar una sobrecarga de hierro, que a su vez puede causar enfermedades del corazón.
  • Esplenectomía(extirpación del bazo)
  • El trasplante de la médula espinal
  • Terapia génica: para lograr que un gen normal se inserte en un genoma del individuo con dicha enfermedad hereditaria.

Factores de riesgo:

  • Etnicidad afroamericana, asiática, china o mediterránea.
  • Antecedentes familiares del trastorno.

 

Incidencia

Las talasemias alfa ocurren con mayor frecuencia en personas del sudeste asiático, Medio Oriente, China y en aquellas de ascendencia africana. Las talasemias beta ocurren en personas de origen mediterráneo, y en menor grado, los chinos, otros asiáticos y afroamericanos.

 

Conclusión:

Luego de llevar a cabo la presente monografía,  se pude considerar que la talasemia es una enfermedad muy distribuida por el mundo, muy poco conocida por la población, aunque con una gran incidencia.

Estando al tanto de la gran distribución mundial de esta enfermedad, y la gran variedad de formas en las que se puede presentar,  es importante dar a conocer la misma, y que sean detectados y alertados por sus médicos aquellos individuos portadores,  en especial, aquellas parejas con probabilidades de concebir hijos con talasemia mayor, teniendo en cuenta las complicaciones que conlleva la herencia de dicha condición.


 

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Parálisis Periódica Hiperkalémica (HYPP) en equinos. Monografías de alumnos

En esta ocasión les dejo la monografìa realizada por la alumna Betiana Tscherig acerca de la  Parálisis Periódica Hiperkalémica (HYPP) en equinos y su forma de diagnóstico por técnicas de biología molecuar. Espero les sirva a todos aquellos en el camino de aprender y los interesados en aprender sobre el tema

Saludos

Gaby

Tscherig. Imagen 2

Escuela de Medicina Veterinaria y Producción agroindustrial.

Parálisis Periódica Hipercalémica (HYPP) en Equinos.

Curso de Genética básica a cargo de Iglesias, Gabriela, año 2015.

Alumna Tscherig Betiana.

 

Parálisis periódica hipercalémica (HYPP) en equinos.

 

Con la presente monografía se darán a conocer con detalles, aspectos propios de la Parálisis Periódica Hipercalémica (HYPP) haciendo especial hincapié en el área genética. Se trata de una enfermedad genética de tipo autosómica dominante presente en los equinos que básicamente afecta los canales de sodio en las células del músculo y la capacidad para regular los niveles de potasio en la sangre.

Esta enfermedad presenta una amplia variedad de síntomas clínicos y se generalizó cuando los criadores trataron de producir caballos con musculatura pesada. Hipótesis que posteriormente se descartó.

Se debe tener presente que dicha afección no solo se produce en equinos sino que también lo hace en los seres humanos, en los cuales se denomina Gamstorp adynamy episódica.

Características propias de la Parálisis Periódica Hipercalémica.

 

Herencia.

La Parálisis Periódica Hipercalémica es una enfermedad muscular que se presenta en los descendientes del semental  Cuarto de Milla “Impressive” (AQHA 767246), oriundo Oklahoma, Estados Unidos. El semen de este equino fue seleccionado y utilizado de manera intensa gracias a las cualidades de conformación de dicho semental, desconociendo aún la mutación. Tal es así que a partir del año 2003 se registraron más de 55.000 equinos vivos relacionados en su genealogía con Imprenssive (según registros de la AQHA), pero se sabe que contribuyó a la composición genética de 2.9 millones de caballos registrados (Rudolph et al., 1992).

En la actualidad se dice que la Parálisis Periódica Hipercalémia equina se presenta en 1 de cada 50 caballos cuarto de milla. También se ha reportado su presencia en varias líneas de caballos tales como Apaloosa y Pintos (Church 1995, Rudolph et a/, 1992).

En 1996, el Dr. Naylor sugirió como hipótesis que las anomalías en la transmisión del potencial de membrana de los caballos HYPP-positivo podrían conducir a la hipertrofia muscular característica en esta línea. Doctores expertos de la Universidad de California Davis y de la Universidad de Valberg, Minnesota, llevaron a cabo los análisis musculares para apoyar o refutar esta hipótesis mediante biopsias del músculo glúteo pero no encontraron ninguna diferencia en cuanto al porcentaje de contracción, edades o tamaño de las fibras y ninguna asociación con la gravedad clínica. Por lo tanto, su investigación descartó la hipótesis del Dr. Naylor.

 

Características genéticas.

La parálisis periódica hipercaliémica (HYPP) es una enfermedad genética de herencia autosómica dominante, es decir que es requerida una sola copia del gen (alelo) para que se presente la enfermedad.

Durante un estudio genético llevado a cabo en Stichting Klinisch Genetisch Centrum de Leiden (Holanda) en humanos se determinó que la enfermedad está causada por mutaciones en el gen SCN4A, que codifica la subunidad alfa (α) del canal de sodio muscular o canal de tipo IV. Se trata de una proteína transmembrana de 1.836 aminoácidos que, junto a la subunidad beta (β) del canal, media la permeabilidad de las membranas musculares excitables a los iones de sodio. El canal adopta conformaciones abiertas o cerradas en función de las diferencias de voltaje y el sodio pasa a través del poro de acuerdo con su gradiente electroquímico. El gen, que tiene 24 exones y se localiza en el cromosoma 17q23.3, fue identificado como la causa de la enfermedad mediante cartografía genética y análisis mutacional. (B. Narberhaus; 2008)

Normalmente para evitar que el músculo se contraiga continuamente, el canal de sodio se cierra mediante su compuerta de inactivación rápidamente después de que se abra y tome contacto con el ion. Con el tiempo, los iones de potasio salen de las células musculares, repolarizando así a las células y provocando el bombeo de calcio fuera del aparato contráctil para relajar el músculo. (Ganong, 2010)

Mediante el estudio génico de Narberhaus y otros investigadores, se determinó además que se presenta un cambio en heterocigosis, una transición nucleotídica de Citocina a Timina en el exón 13 del gen, que resulta en una sustitución aminoacídica de treonina (Thr) a metionina (Met) en el residuo 704 de la proteína (c.2111C>T, p.Thr704Met).

En cambio, en el equino esta mutación de punto consiste en una sustitución de Citosina a Guanina en el gen que codifica el dominio transmembranal de la sub-unidad alfa del canal de sodio muscular. El intercambio de citosina por guanina de la proteína SCN4A resulta en la sustitución de un residuo fenilalanina por leucina el cual es más pequeño que el residuo de la fenilalanina, resultando fisiológicamente o electroquímicamente en la fuga del ion sodio, a través del poro de la membrana celular que debería permanecer cerrado cuando no está bajo estimulación nerviosa (que generaría una contracción muscular) (Reynolds, 1997). La mutación en esta especie fue aislada en 1994 por investigadores de la Universidad de Pittsburgh, con una subvención de diversas organizaciones de equinos; los mismos desarrollaron un análisis de sangre el cual es utilizado actualmente para la identificación de los individuos afectados.

Las mutaciones, alteran la estructura normal y la función del canal de sodio e interrumpen de este modo la regulación de la contracción muscular, originando así cierta susceptibilidad a los episodios de parálisis del mismo.

“La sustitución aminoacídica impide la inactivación del canal que sigue normalmente a un potencial de acción, dando lugar a un flujo incontrolado de sodio hacia el interior de la fibra muscular. Como consecuencia, la fibra se despolariza activando la entrada de calcio desde el retículo sarcoplasmatico para causar la contracción del músculo, impidiendo la generación de nuevos potenciales de acción. La entrada masiva de sodio dentro de las células provoca una salida de potasio que explica los niveles aumentados de este catión en sangre que son característicos de la enfermedad.” (B. Narberhaus; 2008)

El fallo de los canales de sodio para inactivar correctamente se ve favorecido frente a  factores como el estrés o cuando los niveles de potasio en la sangre fluctúan. Esto último puede ocurrir con el ayuno seguido por el consumo de un alimento rico en potasio, como la alfalfa. (ucdavis.edu., 2015)

Descendencia.

Desde el año 1998, la AQHA (American Quarter Horse) exige revelar la condición genotípica de la HYPP en los documentos de registro de todos los potros que descienden de alguna línea genética identificada como portadora del gen portador. Si un potro y sus progenitores no han sido analizados para el gen HYPP, los documentos de registro deberán llevar la leyenda: “Este caballo tiene un ancestro conocido como portador del gen HYPP, designado de a cuerdo a las reglas de la AQHA como un defecto genético. La AQHA recomienda realizar el examen respectivo para confirmar la presencia o ausencia de este gen” (Crabbe, 1998).

Según los resultados de los análisis realizados a los equinos para el gen HYPP el documento de registro del animal llevará la designación “N/N”, “N/H” o “H/H”. (Ayala, M., 2005)

Homocigota recesivo: N/N. resulta negativo para la enfermedad, lo cual significa que no es portador del gen HYPP y por ende no lo transmiten, aunque sean descendientes de Impressive.

Heterocigota: N/H. si tiene una copia o alelo del gen el caballo resulta positivo a la mutación. Estos caballos se ven afectados en un grado menor.

Homocigota dominante: H/H. Si tiene dos alelos del gen. Darán lugar a toda la descendencia que lleva el gen defectuoso, independientemente del estado del otro progenitor. El fenotipo se muestra como severamente afectado.

Se concluye con esto que los animales homocigótos para la mutación (H/H) son severamente más afectados que los heterocigótos (N/H) (Beech et al., 1993) y por esto se deben de tener en cuenta las siguientes posibilidades de apareamiento:

  • Un equino (♂ o ♀) heterocigótico para la mutación (N/H), tiene un 50% de probabilidad de transmitir una copia del gen anormal (H) a su descendencia cuando es apareado con un equino normal (N/N) mientras que el otro 50% lleva la mutación (N/H).
  • Un equino (♂ o ♀) heterocigótico para la mutación (N/H), tiene un 75% de probabilidad de procrear un potro con HYPP (50% N/H; 25% H/H), cuando es apareado con otro equino también heterocigótico (N/H)
  • Un equino (♂ o ♀) homocigótico para la mutación (H/H), tiene un 100% de probabilidad de procrear un potro con HYPP (100% N/H), cuando es apareado con un equino normal (N/N). . (Ayala, M., 2005)

De esta forma, sólo cruzando animales sanos (N/N), previamente detectados por diagnóstico molecular de Parálisis Periódica Hipercalémica, podría reducirse la incidencia de la mutación y eventualmente eliminarse (Naylor, et al. 1999, Spier, et al. 1990), a la vez que se conservan los rasgos deseables de la línea del semental Impressive. (Spier, 1993).

Sintomatología.

 

Los síntomas principales de la enfermedad en el animal son la rigidez, tremor (hiperexcitabilidad) o debilidad muscular, prolapso del tercer párpado, relincho anormal (por afección de los músculos de la laringe) y convulsiones en ocasiones acompañadas de parálisis de músculos respiratorios y cardiacos que pueden derivar en la muerte por falla cardiaca o respiratoria (Bowling et al., 1996). Estos síntomas se manifiestan principalmente en la etapa adulta de los animales afectados, pero pueden aparecer algunos de ellos  entre los dos a tres años de edad dependiendo de la influencia que tienen las prácticas de manejo como el transporte y la alimentación que estimulan dicha alteración (dado que puede ser agravada por incremento de potasio o frío). Factores como la edad, el género, y la cantidad de músculo no son importantes para la predicción de síntomas HYPP.

 

La HYPP en ocasiones es confundida con el síndrome de cólico ya que los animales afectados normalmente caen por la debilidad muscular, presentando similar incoordinación de las extremidades y los sonidos respiratorios. Pero a diferencia del cólico, la duración de una convulsión es muy rápida y el caballo está totalmente normal después de la recuperación. (ucdavis.edu, 2010)

El ataque convulsivo se produce cuando el potasio sale de la célula al torrente sanguíneo y la célula se llena de sodio produciendo una alteración en la conducción eléctrica hacia los músculos, esto surge como mecanismo compensatorio fisiológico para tratar de evitar el acumulo excesivo de cargas positivas en el interior de la célula. Los equinos son plenamente conscientes y lúcidos durante un ataque. (ucdavis.edu, 2010)

Así mismo, se han reportado manifestaciones subclínicas de animales afectados. (Citado por Moreno Chapa, J. 2007)

 

Diagnostico de la enfermedad

Una forma de llegar al diagnóstico de la enfermedad es analizando una muestra de sangre conservada en citrato sódico tomada durante uno de los ataques, para confirmar la hipercalemia, ya que en ese momento siempre se manifiesta un repentino incremento en la concentración de potasio en suero (por arriba de 8 a 9 mEq/L). Tal aumento indica que se ha alterado la entrada y salida convencional del electrolito. (Wikipedia, 2014)

El genotipo de los individuos también puede determinarse mediante una Prueba de Reacción en Cadena de  Polimerasa y Polimorfismo de Longitud en Fragmentos de Digestión (PCR-RFLP), que consiste en una amplificación in vitro de un fragmento específico del gen (Ácido DesoxirriboNucléico -ADN) del canal de sodio seguida de una separación electroforética de los productos de PCR digeridos por la enzima de restricción Taq I de los productos amplificados (Rudolph et al., 1992). De esta forma, para distinguir entre un individuo que presenta una mutación y otro que no, se elige la enzima de restricción que reconozca su sitio de corte (en un genotipo u otro), de forma que el corte se efectúe sólo en los individuos de un genotipo determinado. Posteriormente se visualizara este polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) del ADN amplificado a través de un corrimiento electroforético en gel de agarosa (Rudolph et al. 1992) mostrando en una o dos bandas los productos de PCR digeridos (Griffiths et al 1995, Puertas 1999). Esta técnica muestra una precisión de 99% (citado por Moreno, J. 2007 desde Bowling et al. 1996).

El fragmento del gen donde se da la mutación a través de la amplificación originada por la enzima termoestable Taq polimerasa, proveniente de una bacteria (Thermus aquaticus),  efectúa el proceso de polimerización de una cadena complementaria de ADN, obteniéndose millones de copias del fragmento de interés. (citado por Moreno, J.)

“La enzima de restricción Taq I lo corta si no existe la mutación, originando dos fragmentos, mientras que si la hay sólo se genera un fragmento para encontrar la mutación dentro del gen específico. Esto consiste en una amplificación de un fragmento específico del gen del canal de sodio, el cual es después digerido con una endonucleasa (enzima de restricción Taq l) que lo corta si no existe la mutación, originando dos fragmentos, mientras que si la hay solo se genera un fragmento” (Rudolph et al. 1992).

Los iniciadores a utilizar permiten la amplificación, por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, de la secuencia correspondiente al segmento del gen donde ocurre la mutación, específicamente en la base nitrogenada 2188 de su ADNc. Los iniciadores de PCR son los siguientes (Rudolph et al. 1992):

IVS2F: 5′-GGGGAGTGTGTGCTCAAGATG-3′

IVS3R: 5′-AATGGACAGGATGACAACCAC-3′

La mezcla de reacción se ejecuta mediante el empleo del estuche para PCR Taq & Go para la amplificación.

Para llevar a cabo la verificación del genotipo las bandas observadas por efecto de la digestión de los productos de PCR por la enzima de restricción, deben evidenciar los siguientes genotipos (Rudholp et al. 1992):

  • Normal (homocigoto recesivo, N/N): una banda de 64 pares de bases (pb) y una banda de 28 pb.
  • Afectado (heterocigoto, N/H): una banda de 92 pb, una de 64 pb y una de 28 p.b.
  • Afectado (homocigoto dominante, H/H): una banda de 92 pb. (Figura 6 del anexo)

Tratamiento.

Los equinos afectados pueden ser tratados con  posibilidad de reducir los signos clínicos, pero el grado que ayuda a tratamiento médico varía entre los individuos. No existe una cura.

Algunos, se ven más afectados por la enfermedad que otros y algunos ataques serán más graves que otros, incluso en el mismo individuo.

Para un atraque leve el tratamiento indicado es un poco de ejercicio, ingestión de alimentos ricos en carbohidratos o suplementados con glucosa. Se pueden necesitar diuréticos como la furosemida para detener los ataques. Acetazolamida y diuréticos de tiazida, tales como clorotiazida también son eficaces.

En cambio, el tratamiento para un ataque severo usualmente consiste en la administración intravenosa de reconstituyentes de dextrosa, calcio y sodio. El calcio intravenoso disminuye la actividad de los canales de sodio pudiendo detener los ataques. (Carlos, J., 2015)

La glucosa por vía intravenosa y la insulina estimula la captación de potasio en la célula por la Na-K ATPasa y pueden reducir la debilidad sin una pérdida de potasio corporal total.

 

Se debe considerar también, la implementación de las buenas prácticas en las explotaciones equinas tales como inocuidad de alimento de los equinos; salud e higiene del personal; calidad del agua de bebida de los equinos; programa para el control de fauna nociva; manejo de excretas y uso apropiado de medicamentos veterinarios (después de realizado el diagnóstico) siendo utilizados de acuerdo a las recomendaciones, dosis, tiempos de retiro y caducidad. (Carlos, J., 2015)

A modo de conclusión y síntesis.

En los pacientes con mutaciones en SCN4A, el canal no es capaz de inactivar, la conductancia de sodio es sostenido y el músculo permanece permanentemente tensa. Como la placa de extremo del motor es despolarizadas, más señales al contrato no tienen ningún efecto. La condición es hiperpotasemia debido a una concentración de iones de potasio extracelular alta hará que sea aún más desfavorable para el potasio a salir de la celda con el fin de repolarise que el potencial de reposo, y esto aún más prolonga la conductancia de sodio y mantiene el músculo contraído. Por lo tanto, la gravedad se reduciría si las concentraciones de iones de potasio extracelulares se mantienen bajos.

Ésta mutación no se originó como el producto de endogamia, sino que se empezó a manifestar debido a las cruzas selectivas de buscar animales con mejor musculatura (Moreno, J., 2007). Además, como la HYPP es una enfermedad de herencia dominante puede transmitirse a otras razas de caballos que utilicen Cuarto de Milla en su conformación genética.

Dada la propagación de la enfermedad en el mundo se vuelve más relevante la identificación del genotipo de los equinos para determinar así cuan intensa puede llegar a ser la afección que se presenta con mayor intensidad a los caballos homocigoto dominante (H/H) que los heterocigotos (N/H) y que solamente queda exento de padecerla aquel que posea el gen el homocigoto recesivo (N/N).

 

Anexo

Tscherig. Imagen 1.

 

Tscherig. Imagen 2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1: Fotografia del semental  Impressive (1969-1995) de raza Cuarto de Milla. Campeón y padre de caballos campeones en conformación.

 

Tscherig. Imagen 3

 

Figura 2: Extraída del artículo Parálisis periódica hipercaliémica: presentación de una familia española con la mutación p.Thr704Met en el gen SCN4A en el cual se muestra el ideograma del cromosoma y un esquema del gen que se presenta de manera similar en los equinos.

 

 

 

Tscherig. Imagen 4

Figura 3: Ejemplo de interpretación de resultados del tratamiento de los productos de PCR con la enzima de restricción Taq I. Se muestra los genotipos homocigoto dominante (normal, NN) en el carril 1, heterocigoto (portador, NH) en el carril 2 y homocigoto recesivo (afectado, HH) en el carril 3. Se utilizó el marcador de peso molecular Hiperladder V para verificar el tamaño de los productos de PCR (Moreno Chapa, J. 2007).

Tscherig. Imagen 5

 

Figura 4. Ejemplo de visualización en el fotodocumentador  Fluor- S Multimager*1 (Bio- Rad) de la purificación de ADN a partir de muestras sanguíneas. Carriles 1 y 10: Marcador de peso molecular; carriles 2 a 8: productos de PCR; Carril 9: control negativo. Puede verse que todas las muestras, excepto la del carril 3,(quizá debido a errores de preparación de la mezcla de reacción para PCR siendo ideal que se repitiera el proceso de amplificación)  mostraron el producto de PCR esperado de 92 p. b. (Moreno Chapa, J . 2007)

 

Tscherig.Imagen 6

 

Figura 5: Ejemplo de visualización de análisis RFLP. Puede verse que la Muestra 1 tiene las bandas de 92 y 64 pb., mientras que la muestra 2 solo tiene la banda de 64 pb. La banda de la muestra 3 es un dímero de iniciador. (Moreno Chapa, J., 2007)

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